內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏烏頭堿類含量分析△

錫林通嘎拉嘎，那生桑

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學處，呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特 010110)

·基礎(chǔ)研究·

內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏烏頭堿類含量分析△

錫林通嘎拉嘎1，那生桑2*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學處，呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，呼和浩特 010110)

目的：對內(nèi)蒙古中東部地區(qū)生長的草烏藥材有效成分烏頭堿類的含量進行分析比較。方法：采用高效液相色譜法，Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈-四氫呋喃(25∶15)，B：0.1 mol·L-1乙酸銨溶液(每1000 mL加0.5mL冰乙酸)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：235 nm；進樣量：10 μL；梯度洗脫VA：1～48 min=15～26，48～60 min=26～35，測定草烏有效成分烏頭堿類的含量進行比較。結(jié)果：內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏總酯型烏頭堿質(zhì)量分數(shù)分別為10.899、7.841、12.729、8.399、8.625、8.461、7.515、15.283 mg·g-1，總烏頭原堿質(zhì)量分數(shù)分別為0.521、0.390、0.514、0.545、0.114、0.112、0.115、0.823 mg·g-1。結(jié)論：內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏有效成分含量差異較大，建立蒙藥草烏統(tǒng)一標準需要進一步研究分析。

草烏；有效成分；烏頭堿；內(nèi)蒙古中東部地區(qū)

草烏是我國廣泛使用的毒性藥材，也是最常用的傳統(tǒng)蒙藥，用途較廣。從國內(nèi)外文獻可以了解其基源、化學成分、炮制、藥理臨床的研究概況，但尚缺乏系統(tǒng)的研究，而且藥材質(zhì)量不穩(wěn)定，品種混雜，這些都制約了蒙藥產(chǎn)業(yè)化水平和發(fā)展。產(chǎn)地較多、藥材質(zhì)量不一致，給用藥帶來了安全隱患，且各地采集加工和炮制工藝變異很大，缺乏專屬性強的質(zhì)量控制標準。本文對內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏有效成分烏頭堿類的含量進行檢測，為今后蒙醫(yī)臨床用藥及進一步研究草烏藥材資源提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ALH-6000-U艾科浦超純水機(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；島津LC-20A 高效液相色譜儀：P-20A高壓輸液泵、SPD-20A紫外檢測器、CLASS-VP工作站；AB135-S電子天平(瑞士)。

1.2 試藥

苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿(中國食品藥品鑒定研究院，批號分別為111795-200901，111796-201002，111794-200901，110799-200404，110720-201111，110798-200404)；甲醇、乙腈、冰乙酸、四氫呋喃、乙酸銨(天津市精細化工研究所，批號分別為MH-2311，20111214，20110527，20120312，20120312)；純凈水；其余試劑均為分析純。

草烏藥材采集于內(nèi)蒙古中東部地區(qū)(草烏的產(chǎn)地及采集時間見表1)。由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥研究院那生桑教授鑒定為蒙藥草烏。

表1 草烏來源

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿依次稱取1.32、0.58、6.98、3.78、3.69 mg，置同一個25 mL容量瓶，10%鹽酸水溶液溶解，并定容至刻度，待用。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品(批號：20110910)粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入10%鹽酸水3 mL，溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性供試品溶液制備

具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合液補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入10%鹽酸水3 mL溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：乙腈-四氫呋喃(25∶15)，B：0.1 mol·L-1乙酸銨溶液(每1000 mL加0.5 mL冰乙酸)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：235 nm；進樣量：10 μL；梯度洗脫：VA：1 min～48 min=15～26，48 min～60 min=26～35。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

分別取烏頭堿混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，結(jié)果表明陰性對照無干擾。見圖1。

1.苯甲酰新烏頭原堿； 2.苯甲酰烏頭原堿；3.苯甲酰次烏頭原堿；4.次烏頭堿；5.新烏頭堿；6.烏頭堿；A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照。圖1 專屬性高效液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、16 μL，依次注入液相色譜儀，測得峰面積。以峰面積值為縱坐標，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿進樣量(mg·μL-1)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，烏頭堿：Y=1.177×106X+1.527×105，線性范圍0.604 8～2.419 2，r=0.999 8；新烏頭堿：Y=1.225×106X+3.021×104，線性范圍1.116 8～4.467 2，r=0.999 7；次烏頭堿：Y=1.279×106X+1.021×104，線性范圍0.590 4～2.361 6，r=0.999 7；苯甲酰烏頭原堿：Y=1.991×106X-6.425×103，線性范圍0.047 2～0.283 2，r=0.999 6；苯甲酰新烏頭原堿：Y=1.160×106X-5.71 2×103，線性范圍0.105 6～0.633 6，r=0.999 3。由此可見，對照品進樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗

取供試品溶液10 μL，按2.4色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果5種被測化合物的RSD均在1.6%～2.9%之間，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，按2.4色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h測定，5種被測化合物的RSD均在1.6%～3.3%之間，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

取供試品溶液6份，按2.2項下方法制備，按2.4色譜條件測定，5種被測化合物的RSD均在0.75%～2.23%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取2.9項下已測知含量的樣品粉末1 g，共6份，分別精密加入相應(yīng)量的各烏頭堿類對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.4項下色譜條件進行測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.11 樣品含量測定

按2.2供試品溶液的制備方法及2.4色譜條件，對內(nèi)蒙古中東部地區(qū)草烏有效成分進行含量測定，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率結(jié)果

表3 草烏各樣品烏頭堿類成分含量 /mg·g-1

3 討論

3.1內(nèi)蒙古中東部地區(qū)生長草烏有效成分種類及含量有一定的差異，所含烏頭堿雖均以新烏頭堿為主，但以錫林郭勒盟正藍旗地域為界限，靠北區(qū)域的草烏含有一定比例的次烏頭堿，偏南區(qū)域的草烏幾乎不含次烏頭堿。市售草烏商品藥材所含烏頭堿類90%以上為烏頭堿，不含次烏頭堿。首次發(fā)現(xiàn)蒙藥草烏市售商品與自采自用藥材所含生物堿種類截然不同。這是蒙藥草烏藥材質(zhì)量標準研究中急待解決的問題。

3.2市售草烏與內(nèi)蒙古本地生長草烏所含有效成分生物堿種類差異很大，其毒性和療效固然不同。蒙藥早年主要用本地產(chǎn)草烏，故以市售草烏為蒙藥藥材，很大程度上制約了蒙藥療效及獨特用藥特色。

3.3流動相A：乙睛-四氫吠喃(25∶15)，B：0.1 mol·L-1乙酸銨(1000 mL加乙酸0.5 mL)，該條件的酸堿性適中，適用性強。按照《中華人民共和國藥典》梯度進行洗脫，0～45 min(15%→26%A)、48～49 min(26%→35%A)、49～58 min(35%A)、58～65 min(35%→15%A)，基線在52 min時突然飄高，對色譜峰造成干擾。為了克服這種現(xiàn)象，本試驗對流動相的梯度比例進行調(diào)整，梯度洗脫條件：1～48 min(15%→26%A)、48～60 min(26%→35%A)，能克服基線飄高現(xiàn)象，且6種被測組分分離度較好，峰展寬適中。為了使起始基線平穩(wěn)，兩次進樣之間用初始濃度平衡20 min左右，效果滿意。

3.4照《中華人民共和國藥典》2010版草烏項下方法，以異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶劑溶解被測組分，可獲得較穩(wěn)定的結(jié)果，且溶解完全，但峰形不理想，雜質(zhì)甚多。為了克服以上困難，以10%鹽酸水為溶劑，可獲得溶解完全、雜質(zhì)少、峰形滿意且較穩(wěn)定的結(jié)果。

3.5檢測分析中，苯甲酰次烏頭原堿含量過低，相對誤差偏大，雜峰干擾嚴重，故本文忽略。

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AnalysisofAconitineContentinAconitiKusnezoffiiRadixofEasternInnerMongolia

XILINTonggalaga1，NAShengsang2*

(1.InnerMongoliaPeople’sHospitalPharmacyDepartment，Hohhot010017，China；2.InnerMongoliaMedicalUniversity，Hohhot010110，China

Objective：To analyse and compare aconitine content of Aconiti kusnezoffiis Radix from eastern of Inner Mongolia.Methods：The content of aconitine was determined by HPLC.Eclipse XDB-C18column (4.6×250 mm，5 μm) was used with mobile phase of A: Acetonitrile-tetrahydrofuran (25∶15) and B: 0.1 mol·L-1ammonium acetate solution，1000 mL ammonium acetate solution with 0.5 mL acetic acid.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 235 nm.The injection volume was 10 μL.Gradient elution was: VA:1 min～48 min=15～26，48 min～60 min=26～35.Results：The total ester type aconitine content (mg·g-1) were 10.899，7.841，12.729，8.399，8.625，8.461，7.515，15.283，respectively.The total aconitine content (mg·g-1) were 0.521，0.390，0.514，0.545，0.114，0.112，0.115，0.823，respectively.Conclusion：The difference of the content of active components in Aconiti Kusnezoffii Radix differences in eastern of Inner Mongolia area is large，a further study is needed for establishing a unified standard of Aconitum Kusnezoffii Radix in Mongolian medicine.

Aconiti Kusnezoffii Radix；active ingredients；aconitine；eastern of Inner Mongolia

2014-09-02)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學博士基金(NY2010BQ006)

*

那生桑，教授，博士生導師，研究方向：蒙藥現(xiàn)代化；E-mail：nasang56@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.011