山羊角藥材的HPLC指紋圖譜研究△

康馨元，劉睿，李春楠，錢(qián)大瑋，孫佳明，段金廒，張輝*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

·基礎(chǔ)研究·

山羊角藥材的HPLC指紋圖譜研究△

康馨元1，劉睿2，李春楠1，錢(qián)大瑋2，孫佳明1，段金廒2，張輝1*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

目的：建立山羊角藥材的HPLC指紋圖譜。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：建立了10個(gè)不同產(chǎn)地山羊角藥材的共有圖譜，確定了10個(gè)共有峰，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)指認(rèn)了其中4個(gè)共有峰，并采用聚類(lèi)分析、主成分分析、相似度分析的方法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便快速、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于山羊角藥材的鑒別和評(píng)價(jià)。

山羊角；高效液相色譜法；指紋圖譜

山羊角為牛科山羚屬動(dòng)物青羊NaemorhedusgoralHardwicke、山羊?qū)賱?dòng)物北山羊CapraibexLinnaeus的角。其首載于《本草新編》，曰其“專(zhuān)活死血”[1]?！都种胁菟帯分钙淠苕?zhèn)靜、退熱、明目、止血[2]。山羊角主要有甾族、磷脂類(lèi)、角蛋白、多肽及氨基酸類(lèi)成分，與羚羊角的化學(xué)成分相似。研究表明，山羊角具有解熱、鎮(zhèn)靜、催眠[3]、鎮(zhèn)痛[4]、解痙、降壓等作用，且鎮(zhèn)靜作用較羚羊角稍強(qiáng)[5]。

目前，對(duì)于山羊角的研究大多集中在與羚羊角進(jìn)行藥理作用及性狀上的比較和鑒別[3-7]，鮮有單獨(dú)針對(duì)山羊角的報(bào)道[8-10]。由于山羊角藥材粉末顏色均不統(tǒng)一，易與其他角類(lèi)藥材相混淆，故本試驗(yàn)收集3種可能作為山羊角混偽品的藥材進(jìn)行對(duì)比分析。采用高效液相色譜法建立不同產(chǎn)地山羊角藥材的指紋圖譜，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，綜合運(yùn)用相似度分析、聚類(lèi)分析以及主成分分析方法對(duì)山羊角及其偽品色譜圖進(jìn)行分析，為山羊角的鑒別提供依據(jù)，為山羊角的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器及材料

1.1 儀器、試劑

1260系列高效液相色譜儀[包括二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、化學(xué)工作站、自動(dòng)進(jìn)樣器]、1100 series LC-MS液質(zhì)聯(lián)用儀[包括Agilent SL 型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、自動(dòng)進(jìn)樣器、Chemistation 化學(xué)工作站等](美國(guó)Agilent公司)、HS2060型超聲波清洗器(HENGAO T&D)；BSA124S-CW型萬(wàn)分之一電子天平(Sartorius)。

對(duì)照品尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100469-201302，140661-200903，110887-200202，100879-200202)；乙腈為色譜純(Fisher公司)；水為二次蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材

山羊角藥材來(lái)源于浙江、河北、江蘇、廣東、黑龍江、內(nèi)蒙古、安徽7省共10個(gè)地區(qū)，由東豐制藥有限公司提供，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心張輝教授鑒定為牛科動(dòng)物青羊NaemorhedusgoralHardwicke的角，見(jiàn)表1。偽品包括水牛角(吉林大藥房)、牛蹄甲(吉林省敦化市)以及綿羊角(吉林省大安市)。

表1 山羊角藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取山羊角粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入5 mL水，稱(chēng)定重量，超聲處理1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水，梯度洗脫，見(jiàn)表2。

表2 山羊角高效液相指紋圖譜梯度洗脫方式

2.2.2 質(zhì)譜條件 電離源：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：正負(fù)離子檢測(cè)；掃描范圍：m/z 50～800；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9 mL·min-1；霧化氣壓強(qiáng)：0.24 Mpa；毛細(xì)管電壓：4 kV。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(7)，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行檢測(cè)，考察各主要色譜峰與內(nèi)參比峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.61%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.87%。通過(guò)“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件(2004A)”計(jì)算，相似度均大于0.995，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液(7)，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各主要色譜峰與內(nèi)參比峰保留時(shí)間的一致性，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.10%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.20%。通過(guò)“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件(2004A)”計(jì)算，相似度均大于0.999，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(7)6份，同法檢測(cè)，考察各主要色譜峰與內(nèi)參比峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.20%，相對(duì)峰面積RSD均小于4.88%。通過(guò)“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件(2004A)”計(jì)算，相似度均大于0.998，表明本法重復(fù)性良好。

2.4 樣品測(cè)定

按2.1項(xiàng)下方法制備10批供試品溶液，分別吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件注入高效液相色譜儀，進(jìn)行分析。選擇10個(gè)共有色譜峰，將色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件(2004A)”，生成共有模式。取供試品溶液10 μL，按2.2.2項(xiàng)下的質(zhì)譜條件注入液質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合色譜峰的紫外色譜圖、一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，指認(rèn)出3、5、6、9號(hào)峰分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷，見(jiàn)圖1。指認(rèn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 山羊角指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 內(nèi)參比組分的選擇 為消除測(cè)定結(jié)果的系統(tǒng)誤差，選定峰形對(duì)稱(chēng)、峰面積較穩(wěn)定的保留時(shí)間為11.3 min的7號(hào)色譜峰作為內(nèi)參比組分，以便計(jì)算同種山羊角的共同特征組分的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積值。結(jié)果見(jiàn)表4～5。

注：A.共有模式色譜圖；B.已知化合物色譜圖；3.尿嘧啶；5.次黃嘌呤；6.尿苷；9.腺苷。圖1 山羊角藥材的共有模式圖及已知化合物的高效液相色譜圖

表3 山羊角色譜峰的HPLC-DAD-ESI-MS(n)分析結(jié)果

表4 山羊角樣品10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間 /min

表5 山羊角樣品10個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積

2.5.2 特征指紋圖譜的建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件A版”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，設(shè)定安徽合肥的山羊角藥材圖譜為參照?qǐng)D譜，將其他樣品測(cè)得的色譜峰與參照?qǐng)D譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成山羊角指紋圖譜共有模式，見(jiàn)圖2。不同產(chǎn)地山羊角藥材指紋圖譜存在一定的差異，其共有峰相對(duì)保留時(shí)間基本一致。

注：S1～S10.1～10號(hào)樣品；R.對(duì)照?qǐng)D譜。圖2 10批山羊角藥材的高效液相色譜圖

2.5.3 主成分分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，將山羊角藥材指紋圖譜的特征峰數(shù)據(jù)化(特征數(shù)據(jù)化結(jié)果為峰面積與相同峰平均峰面積之比)，輸入SPSS 17.0軟件，對(duì)10個(gè)共有峰進(jìn)行主成分分析。第一主成分以3、5、8、7、2為主，占信息量的38.694%；第二主成分以9、6、5號(hào)峰為主，占信息量的18.952%；第三主成分以7、5、4為主，占信息量的17.550%。前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為75.196%，基本反映了總體信息。由相關(guān)文獻(xiàn)[11]可知，根據(jù)各個(gè)峰在3個(gè)主成分中的總分量可計(jì)算出各個(gè)峰的權(quán)重，權(quán)重較高的峰所代表的成分在山羊角中的含量可作為分析、優(yōu)選山羊角藥材的指標(biāo)。通過(guò)計(jì)算，排在前幾位的依次為9、7、5、3號(hào)峰，見(jiàn)表6。由2.4項(xiàng)下特征峰的指認(rèn)結(jié)果可知，此4個(gè)峰除未知的7號(hào)峰之外，全部為核苷成分。

表6 公共因子載荷矩陣表

2.5.4 聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析[12]是一種無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法，依據(jù)樣品或變量在性質(zhì)上的親疏程度進(jìn)行分類(lèi)。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，將山羊角樣品及偽品藥材指紋圖譜的特征峰數(shù)據(jù)化，輸入SPSS 17.0軟件，進(jìn)行聚類(lèi)分析，見(jiàn)圖3。

注：1.安徽合肥；2.河北保定；3.廣東電白；4.河北安國(guó)；5.浙江金華；6.浙江縉云；7.黑龍江雞西；8.內(nèi)蒙古阿拉善；9.浙江紹興；10.江蘇盱眙；11.綿羊角；12.牛蹄甲；13.水牛角。圖3 山羊角及偽品藥材指紋圖譜聚類(lèi)分析結(jié)果

聚類(lèi)分析圖反映的是各樣品的相似程度，樣品間的分類(lèi)距離越小，則樣品間的差異越小，反之則越大[13]。當(dāng)距離標(biāo)尺在1時(shí)，樣品3、9歸為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在2時(shí)，樣品3、9與樣品5聚為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在3時(shí)，樣品2、4聚為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在4時(shí)，樣品6、8聚為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在5時(shí)，樣品3、9、5與樣品1聚為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在9時(shí)，樣品10與3、9、5、1聚為一類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在11、12時(shí)，樣品3、9、5、1、10依次與樣品2、4以及樣品6、8聚為一大類(lèi)；當(dāng)距離標(biāo)尺在14時(shí)，樣品7與其他所有產(chǎn)地山羊角藥材聚為一類(lèi)；而偽品13、12、11的距離標(biāo)尺均大于17。聚類(lèi)結(jié)果呈現(xiàn)一定的規(guī)律，相鄰的浙江、安徽、江蘇省山羊角藥材首先聚為一類(lèi)，再依次與河北省、內(nèi)蒙古山羊角藥材聚為一類(lèi)，最后與黑龍江省藥材聚為一類(lèi)，由南向北依次聚類(lèi)。以距離標(biāo)尺為考察指標(biāo)，可以看出山羊角樣品與偽品區(qū)別明顯。

2.5.5 指紋圖譜相似度計(jì)算 應(yīng)用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”軟件，校正選峰，設(shè)定匹配模式，將色譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，進(jìn)行色譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)。通過(guò)軟件得出山羊角HPLC指紋圖譜共有模式，與共有模式比較，得出10批不同產(chǎn)地山羊角的相似度。結(jié)果表明，10批山羊角藥材中除第1、3、10批藥材的相似度低于0.90外，其他7批藥材指紋圖譜的相似度均在0.90以上，指紋圖譜相似度均較高，見(jiàn)表7。

2.5.6 指紋圖譜專(zhuān)屬性分析 取綿羊角、牛蹄甲、水牛角藥材粉末，分別以2.1項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。各吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，三者的色譜圖與山羊角藥材色譜圖有顯著差別。

表7 山羊角藥材指紋圖譜的相似度

與山羊角藥材指紋圖譜的共有峰相比，綿羊角未檢測(cè)出6、8、9號(hào)共有峰，牛蹄甲未檢測(cè)出6、9號(hào)共有峰，水牛角未檢測(cè)出9號(hào)共有峰。除色譜峰數(shù)量差異外，色譜峰峰面積也存在較大差異。因此，山羊角藥材指紋圖譜的建立為有效地鑒別混偽品綿羊角、牛蹄甲以及水牛角提供了依據(jù)。

注：A.綿羊角；B.牛蹄甲；C.水牛角。圖4 偽品高效液相色譜圖

3 討論

筆者通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)以及洗脫程序的詳細(xì)考察，所采用的色譜條件對(duì)山羊角藥材分離效果較理想。并通過(guò)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可用于山羊角藥材的高效液相指紋圖譜研究。

本文首次建立山羊角藥材高效液相指紋圖譜，并指認(rèn)出4個(gè)特征峰，分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷和腺苷。指紋圖譜顯示，10批樣品色譜峰的整體相貌大致相同，都出現(xiàn)了相應(yīng)的特征性成分峰，大部分藥材指紋圖譜的相似度在0.90以上，安徽合肥、廣東電白、江蘇盱眙藥材的相似度在0.8以上，不同產(chǎn)地的指紋圖譜仍存在一定的差異。共有峰主成分分析結(jié)果可知，核苷成分在區(qū)分不同產(chǎn)地山羊角藥材中起到重要作用，可作為評(píng)價(jià)山羊角藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分。

通過(guò)專(zhuān)屬性分析及聚類(lèi)分析，將山羊角藥材及其偽品進(jìn)行了有效區(qū)分，與山羊角指紋圖譜共有峰相比，各偽品均有未檢測(cè)出的共有峰。在聚類(lèi)分析中偽品與10批山羊角樣品分類(lèi)距離較大，差異明顯。且不同產(chǎn)地樣品也呈現(xiàn)一定的規(guī)律，地理位置越接近的藥材分類(lèi)距離越小，相似度越高，呈現(xiàn)由南向北依次聚類(lèi)的規(guī)律。說(shuō)明地理位置是山羊角化學(xué)成分形成的重要影響因素。

本方法建立的指紋圖譜可快速地對(duì)山羊角偽品與正品進(jìn)行鑒別和區(qū)分，并通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的山羊角藥材指紋圖譜進(jìn)行綜合宏觀(guān)分析，為山羊角藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供依據(jù)，為山羊角的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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StudyonHPLCFingerprintofCaprahireusLinnaeus

KANGXinyuan1，LIURui2，LIChunnan1，QIANDawei2，SUNJiaming1，DUANJinao2，ZHANGHui1*

(1.ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China；2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

Objective：To set u Pthe HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus.Methods：The separation was performed by HPLC.Venusil ASB C18(4.6×250 mm，5 μm)column was used with mixture of 0.1% formic acid-water and acetonitrile as mobile phase in gradient mode.The detection wavelength was 254 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1.Results：The HPLC fingerprint forCaprahireusLinnaeus collected from ten different sources was set up.There were ten common peaks，four of witch had been identified by HPLC-DAD-ESI/MS/MS.The fingerprint was analyzed with methods of cluster analysis，principal component analysis and similarity computation.Conclusion：The method is simple，rapid and can be used for identification and evaluation ofCaprahireusLinnaeus.

CaprahireusLinnaeus；HPLC；fingerprints

2014-08-15)

角類(lèi)動(dòng)物藥的標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目—國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高暨2015版藥典科研任務(wù)(2012)

*

張輝，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)；E-mail：zhanghui_8080@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.010