楊梅素影響 EA.hy926 人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲遷移及微管形成的實(shí)驗(yàn)研究△

秦笑，陳美娟

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)(2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

·基礎(chǔ)研究·

楊梅素影響 EA.hy926 人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、侵襲遷移及微管形成的實(shí)驗(yàn)研究△

秦笑1，陳美娟2*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)(2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的：探討楊梅素抗腫瘤血管新生的作用機(jī)制。方法：用不同濃度的楊梅素作用于體外培養(yǎng)的 EA.hy926 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株，采用MTT 法觀察藥物對細(xì)胞的增殖抑制作用，劃痕法及transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察藥物對細(xì)胞侵襲遷移能力的影響，tube formation 法觀察藥物對微管形成的影響。結(jié)果：楊梅素對EA.hy926細(xì)胞的增殖、侵襲遷移及血管生成呈濃度依賴性抑制，尤其在高濃度下(1 mM)其抑制作用最顯著(P<0.01)。結(jié)論：楊梅素的抗腫瘤血管生成作用不僅通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而且通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲遷移及微管樣結(jié)構(gòu)的形成來實(shí)現(xiàn)。

楊梅素；血管內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；侵襲/遷移；血管生成

楊梅素(myricetin)化學(xué)名為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基黃酮，是一種重要的黃酮醇類化合物，廣泛存在于多種天然植物中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有廣泛的藥理活性。據(jù)報(bào)道，楊梅素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長與增殖、促進(jìn)其凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]，但楊梅素對腫瘤血管新生的抑制作用少有報(bào)道。

本研究用不同濃度的楊梅素對人血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926進(jìn)行干預(yù)，通過MTT法、 transwell小室法、tube formation法等體外實(shí)驗(yàn)觀察楊梅素對細(xì)胞增殖、侵襲遷移及微管形成的影響，進(jìn)一步探討楊梅素抗腫瘤血管生成作用的機(jī)理。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

EA.hy926人血管內(nèi)皮細(xì)胞株購于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清、1%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩種液(HEPES)、青霉素(50 IU·mL-1)、鏈霉素(100 U·mL-1)的1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

楊梅素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>99%，二甲亞砜(DMSO)助溶，1640 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO的終濃度<0.3%)，抽濾除菌。1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；Transwell小室(Corning公司)；胰酶、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

兔抗人MMP-2、MMP-9多克隆抗體(北京博奧森生物有限公司)；鼠尾膠原蛋白(杭州生友生物技術(shù)公司)；Matrigel(BD公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測楊梅素對EA.hy926細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于96孔板，每孔加200 μL細(xì)胞懸液(含3×103個(gè)細(xì)胞)，常規(guī)培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞貼壁，換上梯度濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的含藥培養(yǎng)基，并設(shè)空白對照組。每個(gè)劑量設(shè)6個(gè)平行復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清后每孔加DMSO 200 μL，振蕩器振蕩10 min后，酶標(biāo)儀(美國 BIO-TEK 公司)測定490 nm的吸光度，重復(fù)3次。

2.2 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞消化后用0.1%牛血清白蛋白(BSA)重懸，細(xì)胞(1×106)以每孔100 μL種入transwell小室，加藥刺激，小室外部空間加入600 μL含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基作為化學(xué)趨化劑。置5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)6 h。取出transwell，用棉簽小心將小室膜上表面細(xì)胞去除，取下膜，自然風(fēng)干。甲醇固定5 min，用HE染色法進(jìn)行染色，蘇木素染色10 min，分色劑中浸泡數(shù)秒，再投入伊紅染色2 min，分別用50%、70%、80%、95%、100%乙醇脫水?dāng)?shù)秒，二甲苯透明，中性樹脂封片。下表面細(xì)胞經(jīng)染色后，顯微鏡下觀察、照相，隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算遷移率。

2.3 楊梅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響

鼠尾膠原蛋白凝膠的制備(以1 mL為例)：取200 μL鼠尾膠原蛋白，置于冰浴的離心管中，加入690 μL蒸餾水，立即混勻，加入到含12 μL濃度為0.1 mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，混勻，再加入100 μL的10×PBS，混勻，每孔100 μL種于96孔板。先置于25 ℃ 20 min，再置于37 ℃過夜。將細(xì)胞消化，重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105，每孔100 μL種于凝膠上，含終濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的藥物。孵育12 h，觀察小管形成情況。

2.4 明膠酶譜法檢測楊梅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP2、MMP9的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，加入含不同濃度楊梅素的無血清培養(yǎng)液300 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集藥物作用后細(xì)胞的無血清培養(yǎng)液，以12 000 rpm離心5 min，除細(xì)胞碎片，收集上清，立即使用或-70 ℃保存。BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，根據(jù)蛋白濃度分別取相應(yīng)的上清，與等量的上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。制備10%分離膠和5%濃縮膠，分離膠中加入終濃度為0.32 mg·mL-1的明膠，以80 V電泳至溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠，加壓至110 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)前沿至凝膠前端約1 cm，停止電泳、剝膠，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，移入100 mL 2.5%TritonX-100溶液中，在搖床上低速搖動(dòng)，以洗脫SDS。0.5 h后，用蒸餾水漂洗，換新的TritonX-100溶液，繼續(xù)洗脫0.5～l h。用蒸餾水漂洗后，加100 mL明膠酶緩沖液，在37 ℃恒溫溫育42 h。凝膠用蒸餾水漂洗后，放入染色液(0.05%考馬斯亮蘭R-250，以甲醇-水-冰醋酸=45∶45∶10溶解)中，染色4 h，漂洗后，在脫色液(甲醇-水-冰醋酸=45∶45∶10)中脫色1～2 h，至對照出現(xiàn)清晰的負(fù)染酶帶，在凝膠成像儀中照相，觀察條帶變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 楊梅素對EA.hy926細(xì)胞增殖的影響

MTT法觀察不同濃度的楊梅素對EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的楊梅素作用細(xì)胞24 h后，對EA.hy926細(xì)胞的增殖均有抑制作用，其中以1 mmol·L-1的藥物抑制最為顯著(P< 0.01)，見圖1。

注：與對照組相比**p< 0.01。圖1 不同濃度楊梅素對EA.hy926細(xì)胞生長的抑制率(n=6)

3.2 transwell實(shí)驗(yàn)檢測楊梅素對EA.hy926細(xì)胞侵襲能力的影響

transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測楊梅素對EA.hy926細(xì)胞侵襲能力的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊梅素處理后，EA.hy926細(xì)胞的侵襲能力下降，且呈劑量依賴性。濃度分別為0、0.01、0.1、1 mmol·L-1的楊梅素處理各組遷移過膜的細(xì)胞數(shù)分別為(171±13.4)、(76.8±9.19)、(47.2±2.9)、(34.4±5.5)，各濃度組與陰性對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，其中1 mmol·L-1處理組與陰性對照組之間差異極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。見圖2。

注：A.Control；B.0.01 mmol·L-1；C.0.1 mmol·L-1；D.1 mmol·L-1。下同。圖2 楊梅素對細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的影響

3.3 楊梅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響

楊梅素濃度為0的陰性對照組和0.01 mmol·L-1的處理組在12 h時(shí)均已出現(xiàn)微管樣結(jié)構(gòu)，并隨著時(shí)間延長逐漸顯著；而濃度為0.1、0.01 mmol·L-1處理組典型的微管樣結(jié)構(gòu)明顯減少。見圖3。

圖3 不同濃度楊梅素對EA.hy926細(xì)胞微管形成的影響

3.4 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

明膠酶譜法檢測結(jié)果顯示，在楊梅素處理細(xì)胞24 h后，其高劑量組(1 mmol·L-1)對MMP-2和MMP-9的酶解條帶都有顯著抑制作用，尤其是對MMP-9的抑制作用更顯著。見圖4。

圖4 明膠酶譜法檢測不同濃度的楊梅素對EA.hy926細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響

4 討論

當(dāng)腫瘤的生長超過一定體積后，必須有新的血管為其提供氧氣和營養(yǎng)，并帶走代謝產(chǎn)物，否則腫瘤的生長將處于休眠狀態(tài)。腫瘤血管生成是指腫瘤細(xì)胞誘發(fā)的毛細(xì)血管新生以及腫瘤中微循環(huán)網(wǎng)的形成，為實(shí)體瘤的后續(xù)生長提供物質(zhì)基礎(chǔ)?；诖死碚?，抗血管生成的治療策略成為腫瘤治療的熱點(diǎn)方向之一。

腫瘤新生血管的生成過程及調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，其基本過程包括內(nèi)皮細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞及其支持細(xì)胞分泌的趨化因子募集至腫瘤部位后，在各種生長因子的作用下大量增殖并相互黏附，重排組成血管。在此過程中，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力、到達(dá)新生部位后的增殖能力及血管形成能力是有關(guān)腫瘤新生血管形成的幾個(gè)重要因素[4-5]。

本研究選擇EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對象，通過觀察楊梅素對其增殖能力、侵襲遷移能力及血管形成能力的影響，評(píng)價(jià)楊梅素對腫瘤新生血管形成的抑制作用。研究結(jié)果表明，楊梅素在高劑量下，即1 mmol·L-1的劑量下對EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲遷移及微管生成具有顯著的抑制作用。

另外，在內(nèi)皮細(xì)胞降解并穿透血管與腫瘤間基質(zhì)，到達(dá)腫瘤部位的過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidases，MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)是重要的一環(huán)。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，高劑量(1 mmol·L-1)的楊梅素對MMP-9和MMP-2的蛋白水平均有顯著的抑制作用。

綜上所述，楊梅素在較高的劑量下能通過抑制細(xì)胞的增殖、侵襲遷移及微管形成起到抗腫瘤新生血管形成的作用。

[1] 林國鋇，謝燕，李國文.楊梅素的研究進(jìn)展[J].國際藥學(xué)研究雜志，2012，39(6)：483-487.

[2] 代雄，顏杰寬，甘秀海.黃酮類化合物研究進(jìn)展[J].貴州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29(9)：302-306.

[3] Deeba N S，Vaqar M A，Mohammad I K，et al.Inhibition ofAkt/mTOR signaling by the dietary flavonoid fisetin[J].Anticancer Agents Med Chem，2013，13(7)：995-1001.

[4] 陳信義，徐力，張燕明，等.惡性腫瘤新生血管研究進(jìn)展[J].癌癥進(jìn)展雜志，2005，3(6)：528-533.

[5] 趙黎明，徐寒梅，奚濤.腫瘤血管生成及其抑制劑研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2010，17(5)：457-461.

InhibitoryEffectsofMyricetinonAngiogenesisofHumanEA.hy926cells

QINXiao1，CHENMeijuan2*

(1.ThePre-clinicalMedicineCollege，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicine(TCM)PreventionandTreatmentofTumor，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To explore the inhibition effects of myricetin on angiogenesis of human EA.hy926 cellsin vitro.Methods：MTT assay，transwell assay and matrigel tube-formation assay were used to detect the effects of myricetin on the proliferation，invasion and tube-formation of EA.hy926 cells.Gelatin zymography assay was used to detect the effects of myricetin on the enzyme activities of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9).Results：At the concentration of 1 mmol/L，myricetin effectively inhibited the proliferation，invasion and tube-formation of EA.hy926 cells(P<0.01).Conclusion：Myricetin inhibits angiogenesis of EA.hy926 cells mainly through inhibiting the proliferation，invasion and tube-formation in EA.hy926 cells.

Myricetin；EA.hy926 cells；proliferation；invasion；angiogenesis

2015-02-28)

江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)；江蘇自然基金(BK20131415)；歐盟第七框架項(xiàng)目(PIRSES-GA-2013-612589)

*

陳美娟，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤及其機(jī)制；E-mail：mjchen9680@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.007