苦石蓮膠囊中Neocaesalpin L的含量測定△

唐炳蘭，莫單丹，袁經(jīng)權(quán)，劉振杰，周小雷

(廣西藥用植物研究所 天然藥物化學(xué)組分研究室，廣西 南寧 530023)

·中藥工業(yè)·

苦石蓮膠囊中Neocaesalpin L的含量測定△

唐炳蘭，莫單丹，袁經(jīng)權(quán)，劉振杰，周小雷*

(廣西藥用植物研究所 天然藥物化學(xué)組分研究室，廣西 南寧 530023)

目的：建立測定苦石蓮膠囊中Neocaesalpin L含量的反相高效液相色譜法。方法：色譜柱為伊力特ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5%磷酸水梯度洗脫；檢測波長為210 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL·min-1。結(jié)果：Neocaesalpin L在0.74～3.16 μg線性關(guān)系良好，r=0.999 9，Neocaesalpin L平均回收率為96.76%，RSD=1.59%(n=9)。結(jié)論：該方法簡單，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可有效控制苦石蓮膠囊的質(zhì)量。

苦石蓮膠囊；Neocaesalpin L；含量測定；高效液相

苦石蓮膠囊是廣西藥用植物研究所根據(jù)民間驗方自制的單方制劑，具有消炎、抗菌、抗病毒、護(hù)肝等功能[1-3]，常用于感冒和肝炎的防治?？嗍徬刀箍圃茖崒僦参镟骨v云實(南蛇簕)CaesalpiniaminaxHance的種子，性涼，味苦。有清熱解毒、化濕、散瘀止痛之功能，主治風(fēng)熱感冒、痢疾、淋濁、癰腫、瘡癬、跌打損傷、毒蛇咬傷等。為瑤藥經(jīng)典老班藥中“七十二風(fēng)”中的南蛇風(fēng)[4-5]。化學(xué)成分主要有二萜類、黃酮類、揮發(fā)油成分、植物甾醇類?，F(xiàn)代藥理研究表明，其中所含的二萜類化合物具有抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，是其發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。本文前期對苦石蓮的化學(xué)成分做了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)其富含卡山烷二萜類化合物Neocaeslpin L。藥理研究發(fā)現(xiàn)，Neocaeslpin L有較好的抗流感病毒和抗瘧疾活性[3]，是苦石蓮的有效成分之一。目前文獻(xiàn)尚未見到關(guān)于高效液相色譜測定苦石蓮含量的報道，為了更好地控制本品質(zhì)量，本文采用反相高效液相色譜梯度洗脫法對苦石蓮膠囊中Neocaeslpin L含量進(jìn)行測定，并考察該方法的準(zhǔn)確性[7-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀；KQ-5200型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2004電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠)；W201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)。

1.2 試藥

Neocaesalpin L對照品(自制，經(jīng)NMR、HPLC測定，純度>98%)；苦石蓮膠囊(廣西藥用植物園制藥廠，批號分別為20120407，20120418，20120502)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：伊力特ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸水梯度洗脫(乙腈在0～25 min為20%→50%，26～30 min為50%→20%)；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量為對照品7 μL，樣品10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取Neocaesalpin L對照品2.43 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.243 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取苦石蓮膠囊內(nèi)容物約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，超聲提取30 min，過濾，濾渣再加甲醇40 mL，超聲提取30 min，過濾。合并2次濾液，水浴蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別取對照品溶液7 μL、供試品溶液和不含苦石蓮的陰性溶液10 μL進(jìn)樣測定。在選定色譜條件下，樣品中Neocaesalpin L與其他組分達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度>1.5，理論塔板數(shù)按Neocaesalpin L峰計算不低于5000。供試品溶液與對照品溶液在同一時間出現(xiàn)色譜吸收峰一致，而陰性在此保留時間上未檢出有吸收峰，結(jié)果見圖1。

A．缺苦石蓮的陰性樣品；B.Neocaesalpin L對照品；C.供試品；1.Neocaesalpin L。圖1 苦石蓮膠囊高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品溶液3、5、7、9、11、13 μL進(jìn)樣，按2.1色譜條件測定。以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，Neocaesalpin L的回歸方程：Y=1 408.96X+3.283，r=0.999 9。結(jié)果表明，Neocaesalpin L進(jìn)樣量在0.739～3.159 μg時，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗

取同一份Neocaesalpin L對照品溶液，精密吸取7 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1色譜條件測定峰面積，計算Neocaesalpin L對照品RSD=0.20%(n=6)，表明該試驗方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，測定Neocaesalpin L峰面積，Neocaesalpin L峰面積RSD=1.14%(n=6)，表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品內(nèi)容物約2 g，精密稱定，按2.3項方法制備6份供試品溶液，精密吸取10 μL進(jìn)樣，按2.1色譜條件測定峰面積，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.928 7 mg·g-1，RSD=1.85%(n=6)。

2.9 加樣回收率試驗

取已測含量的同一批樣品約1 g，精密稱定，共9份，分別精密加入樣品的80%、100%、120%的Neocaesalpin L對照品(質(zhì)量濃度為0.302 mg·mL-1)各3份，按2.3項下方法制備成供試溶液。分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，測定Neocaesalpin L峰面積，計算回收率，Neocaesalpin L平均回收率96.76%，RSD=1.59%。結(jié)果見表1。

表1 Neocaesalpin L加樣回收率測定結(jié)果

2.10 樣品測定

取3批樣品(批號分別為20120407，20120418，20120502)，按2.3項下制備方法制備供試品溶液，每一批制備3份，按2.1色譜條件和方法測定峰面積，按外標(biāo)法計算Neocaesalpin L含量，結(jié)果見表2。

表2 苦石蓮膠囊中Neocaesalpin L的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

本試驗選擇二萜類化合物Neocaesalpin L作為苦石蓮膠囊的質(zhì)量控制指標(biāo)，是因為Neocaesalpin L在苦石蓮中含量較高，且具有較好的抗流感病毒和抗瘧疾活性。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

本試驗對樣品超聲處理和加熱回流2種提取方法進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示,超聲提取的效率優(yōu)于回流提取，且超聲方法簡便快捷，提取完全。提取時間分別考察了15、30、60、90、120 min，結(jié)果30 min的提取效率最高。料液比分別考察了2∶20、2∶40、2∶50、2∶60、2∶70、2∶80，結(jié)果表明，料液比為2∶40時提取率最高，故選擇加入甲醇40 mL。提取次數(shù)分別考察了提取1、2、3次，結(jié)果顯示，提取2次苦石蓮中的Neocaesalpin L成分基本能提取完全。綜上所述，采用超聲提取法，提取時間為30 min，甲醇加入量為40 mL，提取2次，苦石蓮中Neocaesalpin L成分的提取率高，干擾峰減少，重復(fù)性良好。

3.3 流動相的優(yōu)化

在選擇流動相過程中，本試驗曾采取甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水等度洗脫，但分離效果均不理想，經(jīng)反復(fù)試驗后發(fā)現(xiàn)以乙腈-磷酸水梯度洗脫時，能使Neocaesalpin L和相鄰物質(zhì)達(dá)到較好的分離，峰形較好。檢測波長選擇方面，對Neocaesalpin L在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，確定最大吸收波長，結(jié)果在210 nm Neocaesalpin L有最大吸收，故選擇檢測波長為210 nm。

[1] 唐炳蘭，繆劍華，程燕，等.壯瑤五驗方抗病毒、抗菌、解熱、鎮(zhèn)痛、消炎作用研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，25(3)：378-380.

[2] 鄒忠杰，龔夢娟.苦石蓮提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，2(12)：3016-3017.

[3] 郭美仙，劉明，施貴榮，等.苦石蓮對小鼠急性實驗性肝損傷的保護(hù)作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20(11)：2786-2787.

[4] 國家中醫(yī)藥管理局.中華本草：第四分冊 [M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998：374-375.

[5] 戴斌.中國現(xiàn)代瑤藥學(xué)[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2009：235-237.

[6] 黃明堦，陳燕丹，魏道智.苦石蓮化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2010，12(1)：11-14.

[7] 覃華亮，韋怡.HPLC測定蒲地藍(lán)消炎片中紫堇靈的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(1)：58-60.

[8] 尹紅衛(wèi)，潘蘇華.HPLC測定復(fù)方銀杏葉刺梨膠囊中銀杏黃酮醇苷的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2015，17(1)：54-57.

Determination of Neocaesalpin L inCaesalpiniaminaxCapsule

TANG Binglan，MO Dandan，YUAN Jingquan，LIU Zhenjie，ZHOU Xiaolei*

(NaturalMedicineResearchLaboratoryofChemicalCompositionInstituteofGuangxiMedicinalPlant，Nanning530023，China)

Objective：To establish an RP-HPLC method for quantitative determination of neocaesalpin L inCaesalpiniaminaxcapsule.Methods：The separation was performed on a Elite ODS C18Column (250 mm×4.6 mm，5 μm) acetonitril-0.5% H3PO4was used as the mobile phase.The detection wavelength was at 210 nm.The temperature was maintained at 30 ℃.The flow rate was 0.8 mL·min-1.Results：The concentration of neocaesalpin L was linear within the range of 0.74-3.16 μg (r=0.999 9).The average recovery and RSD of the method were 96.76% and 1.59% (n=9).Conclusion：The method is accurate，specific，reproducible which can effectively be used in quality control of neocaesalpin L inCaesalpiniaminaxcapsule.

Caesalpiniaminaxcapsule；Neocaesalpin L；content determination；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.018

2015-06-04)

廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技專項(GXYZ1112)；桂科轉(zhuǎn)(1298009-22)；南寧市科技攻關(guān)與新產(chǎn)品試制(201101088C)

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周小雷，高級工程師，研究方向：天然藥物化學(xué)；E-mail：zhouxiaolei123@163.com