紅細胞溶血試驗檢測化妝品眼刺激性的初步研究

劉肅　何華紅?戚莉莉

[摘要] 目的 探討紅細胞溶血試驗在化妝品眼刺激性檢測中的適用性。 方法 選用9種化妝品產(chǎn)品進行眼刺激試驗，確定家兔紅細胞50%發(fā)生溶血時的化妝品濃度（HD50值）和血紅蛋白變性指數(shù)（DI，%），計算刺激指數(shù)IP= HD50/DI，以IP=HD50/DI值作為評價標準，進行眼刺激性分級。將紅細胞溶血試驗刺激性分級結果與家兔眼刺激試驗（Draize eye test）結果進行分級一致性比較，初步分析體外試驗的適用性。 結果 紅細胞溶血試驗與動物實驗結果比較中，9種樣品中有7種結果一致，一致率為77.8%（相關性為0.4962）。 結論 雖然實驗結果說明兩者有一定的相關性，但多方面而言，紅細胞溶血試驗能否真正取代動物實驗還有待商榷。

[關鍵詞]化妝品；眼刺激性試驗；替代方法；紅細胞溶血試驗

[中圖分類號] R115 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2015）16-188-04

Preliminary study on Red blood cell hemolysis test of draize alternatives

LIU Su HE Huahong QI Lili

Guangzhou Institute for Drugs，Guangzhou 510160， China

[Abstract] Objective To study the red blood cell hemolysis test on the applicability of the cosmetic eye irritation test. Methods 9 kinds of cosmetic products are chosen as the subjects， and determine the subjects of rabbit red blood cell hemolysis occurs in 50% subjects （HD50） and the initial concentration of hemoglobin denaturation index （DI， %）， the calculation of IP=HD50/DI， with IP=HD50/DI value as evaluation standard， make eye irritant grading. Results excitant grading erythrocyte hemolysis test and animal experiment results are compared， and grading consistency preliminary analysis the applicability of the in vitro. Results： Red blood cell hemolysis test and animal experiment result comparison， seven of nine subjects content is consistent， consistent rate was 77.8%（probability=0.4962）.Conclusion Though the experiment results show that both have certain relevance， but many ways， red blood cell hemolysis test failed to truly replace animal testing.

[Key words] Cosmetics； Eye irritation trial； Alternative methods； Red blood cell hemolysis test

眼刺激性是指動物的眼睛表面（包括角膜，鞏膜及結膜部分）接觸到化學物質從而產(chǎn)生炎癥反應的過程，這個過程有可逆的，也有不可逆的。化妝品眼刺激性安全評價方法目前多用家兔試驗即兔的眼刺激性試驗（Draize eye test），該實驗方法于1944年建立，目前仍是測定急性眼毒性的國際標準，但由于該試驗依靠實驗人員肉眼觀察評分給出結果，存在一定的主觀性；同時實驗室與實驗室之間的變異性也使該試驗存在一定誤差。而且近年來從動物保護和動物福利的角度出發(fā)，國際上多種替代動物實驗的體外實驗已經(jīng)建立并被驗證成為檢測標準[1-4]。

紅細胞溶血試驗已經(jīng)被納入到歐洲委員會/英國內(nèi)務府開展的替代家兔眼刺激試驗之一，日本（Japanese ministry of health and welfare，MHW）/JCIA也已經(jīng)在6～9個實驗室進行了類似試驗，結果顯示[1]，紅細胞溶血試驗的實驗室間的重復性較好。盡管它與兔眼刺激性試驗中的MAS值的相關性不夠強（-0.631），但仍可比較確定的從樣品中分辨出強刺激物。

我國已建立了紅細胞溶血試驗方法， 并得出紅細胞溶血試驗的結果與兔眼刺激性試驗具有較好相關性這一結論。張文改等[4-6]認為該實驗方法適合評價洗發(fā)護發(fā)類化妝品的眼刺激性，能正確區(qū)分眼刺激性級別為輕刺激性及其以下刺激級別的化妝品；廖艷等[7]的研究結果也表明紅細胞溶血試驗可用于替代兔眼刺激性試驗。

本研究擬在我所建立兔紅細胞溶血試驗模型，將其應用于化妝品原料和產(chǎn)品眼刺激性的檢測與評價，以考察它替代動物眼刺激性試驗用于化妝品安全性評價的可能性及應用前景。

1 材料與方法

1.1 樣品及試驗動物

全部樣品均來源于廣州市藥品檢驗所藥理室2014年1～9月送檢的部分化妝品產(chǎn)品，共9個批次樣品，其中面膜類2個，洗發(fā)類1個，去角質類2個，潔面類4個。全部樣品均于密閉、室溫（22℃）下保存。endprint

試驗用家兔來自廣州市藥品檢驗所動物房，經(jīng)檢疫后選用健康成年白色家兔，性別不限，雌性不孕。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器：日立U-3900紫外分光光度計，低溫高速28RS離心機（Biofuge），電子天平AB204-S，六孔水浴TW12。

主要試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS），廣州學友生物科技有限公司；二甲亞砜（DMSO），美國AR公司；草酸鉀，廣州化學試劑廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅細胞溶血試驗 紅細胞懸液的制備：健康家兔心臟取血7mL，加2%草酸鉀溶液1mL，制備成新鮮抗凝兔血，加PBS 10mL稀釋，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品懸液的制備：根據(jù)預實驗，選擇合適的終濃度，配制樣品系列溶液。每種樣品均設立5個試驗劑量。首選PBS為溶劑，對于不溶于PBS的樣品選用DMSO為溶劑（終濃度≤0.5%）。必須保證各稀釋樣品懸液充分混勻。

溶血及蛋白變性測定：樣品組每個濃度2支具塞試管，每管加入樣品懸液10mL；陰性對照組2支具塞試管，每管加入PBS 10mL；陽性對照組2支具塞試管，每管加入蒸餾水 10mL。每支試管加入0.2mL稀釋兔血，輕輕混勻，37℃孵育30min。結束后，離心10min，2000r/min，吸取上清液移入比色皿內(nèi)，于分光光度計540nm，560nm及575nm測其吸光度（A）值。按公式①計算溶血率（%），公式②計算血紅蛋白變性指數(shù)（DI，%）。

①

②

R1為空白對照蒸餾水的離心上清液A575/A540值；R2為樣品離心上清液A575/A540值；R3為陽性對照SDS離心上清液A575/A540值[2]

主要觀察指標：50%紅細胞發(fā)生溶血時的樣品濃度（HD50）、蛋白質變性指數(shù)（DI）、HD50與變性變性指數(shù)DI的比值（IP=HD50/DI）。

陽性對照：以十二烷基硫酸鈉（SDS）為陽性對照，最終實驗濃度為100mg/L。

1.3.2 家兔眼刺激試驗（Draize eye test） 樣品按不同劑量滴入每只試驗動物一側眼結膜囊內(nèi)，另一側為自身對照，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察角膜、虹膜和結膜的反應并評分，以評價樣品對眼睛的刺激作用[6]。

試驗操作：輕輕拉開家兔一側眼睛的下眼瞼，將樣品0.1mL或0.1g迅速滴入眼結膜囊中，令眼瞼被動閉合2～3s，以防止樣品丟失，另一側眼睛不作任何處理以作自身對照。滴入樣品后24h內(nèi)不沖洗眼睛。若試驗結果顯示樣品有刺激性，則另選用3只家兔進行沖洗效果試驗，即給家兔眼滴入樣品后30s，用生理鹽水輕柔快速沖洗至少30s。在滴入樣品后1、24、48、72h以及第4天和第7天對動物眼睛進行檢查，觀察結膜、角膜及虹膜的反應，并在24h時進行熒光素鈉（1%，生理鹽水配制）檢查。如果在72h刺激反應消失，即終止試驗。如有累及角膜或有其他眼刺激作用，7d內(nèi)不恢復者，則繼續(xù)觀察至21 天。每次檢查時均按《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》（2007）中眼損害的評分標準記錄眼刺激反應的積分，最后按分級標準對受試樣品進行眼刺激性分級[4，6]。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用STATA統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。采用秩和檢驗法進行紅細胞溶血試驗刺激性分級結果和動物試驗分級結果進行比較，判斷兩種試驗結果分級的頻數(shù)差別是否存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞溶血試驗結果

溶血率與樣品濃度存在一定的線性關系，以樣品濃度（mg/L）為橫坐標，溶血率為縱坐標可求得HD50值（R2≥0.95）。進而，根據(jù)公式可求得DI及IP=HD50/DI。見表1。

2.2 眼刺激試驗與紅細胞溶血試驗的分級結果比較

動物實驗結果可以分為無刺激性（Ⅰ級）、微弱刺激性（Ⅱ級）、輕度刺激性（Ⅲ級）和嚴重刺激性（Ⅳ級）4個級別。

紅細胞溶血試驗的眼刺激分級為：L/D≥10、1≤L/D<10 、0.1 ≤L/D<1和L/D<0.1分別表示無刺激性（Ⅰ級）、微弱刺激性（Ⅱ級）、輕度刺激性（Ⅲ級）和嚴重刺激性（Ⅳ級）4個級別。

本次實驗測得，9種化妝品樣品中，有7種動物實驗與紅細胞溶血試驗分級結果一致，1種不相符，還有一種無法獲得結果。見表2。

根據(jù)STATA統(tǒng)計分析結果，probability= 0.4962，故按單向有序RC表資料進行秩和檢驗，結果顯示這兩種試驗分類等級的頻數(shù)的差別不顯著，即在一定程度上紅細胞溶血試驗可取代動物實驗。本實驗結果紅細胞溶血試驗與動物實驗結果相關性：9種物質中有7種分級結果一致。

3 討論

紅細胞溶血試驗作為動物眼刺激試驗的替代方法，問世已有20多年，科學家們研究了這兩種方法的相關性、一致性和可靠性等，結論是基本確認紅細胞溶血試驗可以用于眼刺激性的評價，并有較好的準確性和可重復性。遺憾的是，公認的眼刺激性評價標準一直未有確定。紅細胞溶血試驗的基本原理是化學物質對紅細胞膜的破壞從而產(chǎn)生胞質內(nèi)蛋白的變性繼而引起一系列的炎性反應[3，8-12]。不同化學物質損傷紅細胞的具體機制可能存在差異，如表面活性劑可破壞膜的脂質結構，導致膜脆性增加和溶解，而某些酸、堿或有機溶劑可引起大分子蛋白質的沉淀/變性，而某些漂白劑和過氧化物對蛋白質的烷化和氧化攻擊有可能并不表現(xiàn)為細胞膜溶解。通常大多數(shù)“無或弱的刺激物”不引起溶血和蛋白變性：“中度或嚴重刺激物”僅引起溶血而較少引起蛋白變性；“強或腐蝕性物質”易造成嚴重溶血及蛋白變性。當前較為合理的動物實驗替代方案是首先通過物理化學特性預判物質的刺激性程度，而后采用多步體外實驗“自下而上（首先進行非刺激性試驗）”方式準確識別非刺激物，采用“自上而下（首先進行刺激性試驗）”方式準確識別嚴重刺激物[13]。因此，本實驗選擇膜溶解（溶血）和血紅蛋白變性兩個檢測終點，與僅用單一終點的替代方法相比，本實驗能覆蓋不同損傷機制，實驗結果更具有代表性。endprint

也有研究表明，溶血實驗中，選用小型豬紅細胞和大鼠紅細胞檢測，前者更容易得出嚴重刺激性物質的分類結果，提示大型哺乳動物可能比嚙齒類紅細胞更接近人類而適宜進行溶血實驗[14]，我們的實驗選用家兔，更有代表性。

我們同時也看到了局限性：一方面，溶血試驗過程中存在太多不穩(wěn)定因素，而且實驗中樣品種類有限，未能代表性地反應所屬種類的結果；另一方面，在實驗過程中，樣品的配制有一定干擾性：磨砂膏等難溶于溶劑或者是混合不均勻；樣品中色素影響吸光度的測定，從而可影響結果的準確性。酸性物質本身會產(chǎn)生蛋白變性作用，所以對于酸性物質的評價也應謹慎[11]。另外有報道顯示，溶血試驗對于鏈烷醇胺和酒精類物質的檢測陽性率較低，可出現(xiàn)假陰性結果。

[參考文獻]

[1] 程樹軍，焦紅.實驗動物替代方法原理與應用[M].北京：科學出版社，2010：285-304.

[2] Eloísa NA，Rosaura de FP，Octávio AFP，et al.A Reassessment of the In Vitro RBC Haemolysis Assay with Defibrinated Sheep Blood for the Determination of the Ocular Irritation Potential of Cosmetic Products：Comparison with the In Vivo Draize Rabbit Test[J].ATLA ，2008，21（12）：275-284.

[3] 陸澤安，鄭賽華，馬來記，等.綿羊紅細胞溶血試驗用于化妝品眼刺激試驗的動物替代方法研究[J].日用化學品科學：2013，1（36）：23-27.

[4] 張文改，楊杏芬.眼刺激試驗的替代方法及應用策略研究進展[J].華南預防醫(yī)學，2007，33（1）：27-31.

[5] 張文改，楊杏芬.基于細胞的眼刺激性體外替代方法建立與化妝品限刺激性逐步檢測策略的初步研究（碩士學位論文）[D].廣州：中山大學，2007：15-18

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：15.

[7] 廖艷，王雪，張立實，等.溶血試驗作為眼刺激試驗替代方法的研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2002，29（4）：593-595.

[8] 劉天強，肖丹.眼刺激性體外評價方法研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（5）：130-132.

[9] 郭翔，楊杏芬.建立離體兔眼試驗方法及其替代Draize試驗的應用研究（碩士學位論文）[D].廣州：中山大學，2009：21-23

[10] 張文改，楊杏芬，楊穎，等.紅細胞溶血試驗作為眼刺激性替代方法的初步研究[J].中國預防醫(yī)學雜志，2010，11（6）：544-547.

[11] 薛金玉，楊杏芬.基于細胞的眼刺激試驗替代方法的研究進展[J].中國預防醫(yī)學雜志，2009，7（10）：681-684.

[12] 王慶利，彭健.Draize眼刺激性試驗的評價[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，7（5）：301-304.

[13] 楊軍，宋健.化妝品原材料與終產(chǎn)品的眼刺激動物實驗替代策略[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013，11（27）：307.

[14] 敖華英，程樹軍，談偉君.不同哺乳動物紅細胞溶血替代眼刺激實驗的比較[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16（12）：2163-2166.

（收稿日期：2015-04-16）endprint