雞樅菌多糖對急性酒精肝損傷小鼠超微病理結構及ADH2、ALDH2mRNA表達的影響

趙云霞，陶明煊，*，程光宇，邢佳，陸文娟

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210046）

雞樅菌多糖對急性酒精肝損傷小鼠超微病理結構及ADH2、ALDH2mRNA表達的影響

趙云霞1，陶明煊1，*，程光宇2，邢佳1，陸文娟1

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097；2.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210046）

目的：從小鼠肝臟超微病理結構及酒精代謝相關酶乙醇脫氫酶2（alcohol dehydrogenase2，ADH2）、乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase2，ALDH2）的mRNA表達方面研究雞樅菌多糖（refined polysaccharides from Termitomyces albuminosus，RPTA）對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護作用。方法：小鼠被隨機分為空白對照組、模型對照組、藥物對照組（聯(lián)苯雙酯組，150mg/（kg·d））、RPTA各劑量組（100、200、400mg/（kg·d）），連續(xù)灌胃30d，空白對照組灌胃等量生理鹽水。第31天，給予50%乙醇（12mL/kg）建立動物急性肝損傷模型。12h后處死，取小鼠肝臟分別觀察肝組織超微結構變化，并采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應（real time polymerase chain reaction，real time-PCR）法檢測肝臟ADH2和ALDH2的mRNA表達。結果：超微結構觀察結果表明，模型對照組小鼠肝臟細胞內(nèi)可見大量脂滴，細胞核呈不規(guī)則形態(tài)，局部核膜凹陷嚴重，線粒體嚴重變形，線粒體嵴模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重腫脹，核糖體脫落；而RPTA小鼠肝細胞內(nèi)上述病變有所改善，尤以高劑量組最佳。Real time-PCR結果表明，與空白對照組相比，模型對照組ADH2和ALDH2的mRNA表達量降低，而RPTA組隨著劑量的增加ADH2和ALDH2mRNA的表達逐漸升高。結論：RPTA可以上調(diào)ADH2和ALDH2 mRNA的表達，具有改善小鼠酒精性肝損傷狀況的作用。

雞樅菌多糖；酒精性肝損傷；超微病理結構；乙醇脫氫酶2；乙醛脫氫酶2；mRNA

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于飲酒過量引起的中毒性肝臟疾病，重度飲酒者中80%以上有一定程度的脂肪肝，其中10%～35%可發(fā)展為酒精性肝炎，而10%～20%將發(fā)展為肝硬化，尤其是近年來隨著酒精消費的增加ALD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］，ALD已經(jīng)成為當今全世界范圍內(nèi)倍受關注的公共衛(wèi)生問題。ALD的發(fā)病機制目前尚不明確，其發(fā)生可能與多種因素密切相關，酒精在體內(nèi)代謝引起的氧化應激作用被認為是最主要的原因，氧化應激主要會引起肝細胞部分細胞器結構的改變，進而導致肝細胞功能紊亂［2-5］。另有研究［6-10］發(fā)現(xiàn)，乙醇在人體的代謝途徑中，乙醇脫氫酶2（alcohol dehydrogenase2，ADH2）和乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase2，ALDH2）是人體內(nèi)清除乙醇的兩種重要酶，ADH2促使乙醇氧化為乙醛，ALDH2則使得乙醛氧化為乙酸，若這兩種酶的mRNA無法正常表達，將導致酒精代謝發(fā)生異常反應。因此，研究ADH2和ALDH2mRNA的表達對于進一步明確ALD的發(fā)病機理和開發(fā)藥物預防治療ALD有重要意義。

雞樅菌（Termitomyces albuminosus），又叫傘把菇、雞絲菇、白蟻菇等，屬于擔子菌綱，傘菌目，側耳科，雞樅菌屬，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，為珍貴的藥食兩用菌。民間常用于療痔止血，可治脾虛納呆、消化不良等癥［11］?，F(xiàn)代研究表明，雞樅菌含有腦苷、皂苷、多糖、纖維素酶、多酚等多種活性成分［12-15］，具有醒腦、鎮(zhèn)痛抗炎和抗氧化等生物活性［11，16-18］。另有研究表明［19］，多糖類物質(zhì)是雞樅菌中主要的抗氧化活性成分。因此本研究以雞樅菌為原材料，通過超聲波輔助的水提醇沉方法提取雞樅菌多糖，探討雞樅菌多糖對酒精所致小鼠急性肝損傷超微結構的影響及對酒精代謝相關酶ADH2、ALDH2的mRNA表達的干預作用，以期為進一步探究ALD發(fā)病機制、開發(fā)預防ALD的藥物提供理論基礎和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

雞樅菌子實體干品云南麗江市古城區(qū)喜瑪拉雅貿(mào)易有限責任公司。

ICR雄性小鼠（6周齡左右），體質(zhì)量（19.01± 0.82）g，動物實驗在江蘇省中醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心進行，動物飼養(yǎng)許可證號（SYXK（蘇）2012-0047）。

1.2儀器與設備

H-7650日立透射電鏡日本日立公司；Leica EM UC7切片機德國萊卡公司；C2500-R-230V微型高速離心機美國BBI公司；PCR-3A1專用超凈臺新加坡ESCO公司；HH-δ數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司；Stepone plus型熒光定量PCR儀美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1雞樅菌多糖的制備

雞樅菌子實體經(jīng)去雜質(zhì)，剪去含培養(yǎng)基的根部，于60℃低溫烘干后粉碎，過60目篩。將細粉以1∶10（m/V）的料液比加入蒸餾水，于冰浴中100W超聲10min，然后在80℃水浴中熱水浸提2h，4500r/min離心15min，取上清，殘渣以1∶5（m/V）的料液比加入蒸餾水于80℃中水浴提取2h，4500r/min離心15min，取上清，殘渣以1∶3的比例加入蒸餾水，按照上述方法再重復提取一次，合并3次上清液，濃縮至20mL，加4倍體積的95%乙醇靜置過夜。同上條件離心，棄上清液，沉淀于60℃低溫干燥得雞樅菌粗多糖（crude polysaccharides from Termitomyces albuminosus，CPTA），CPTA經(jīng)Sevag法脫蛋白、透析、乙醇沉淀、低溫干燥后得雞樅菌精多糖（refined polysaccharides from Termitomyces albuminosus，RPTA），得率為3.46%，經(jīng)蒽酮-硫酸法［20］測定多糖含量約為75.02%，Bradford法［21］間接測定蛋白質(zhì)含量約為2.11%。

1.3.2造模

小鼠適應性喂養(yǎng)3d，隨機分為空白對照組、模型對照組、藥物對照組（聯(lián)苯雙酯組，150mg/（kg·d））、RPTA各劑量組（100、200、400mg/（kg·d）），每組11只。RPTA溶于蒸餾水，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃30d，實驗期間供給全價顆粒飼料，不限制飲食飲水，空白對照組和模型對照組每天灌胃等體積生理鹽水，實驗至第31天，各組動物禁食不禁水12h后，模型對照組、藥物對照組及RPTA各劑量組以12mL/kg劑量，灌以50%的乙醇溶液，建立動物急性肝損傷模型，空白對照組灌胃等體積生理鹽水。去除死亡小鼠，在灌胃12h后取小鼠肝臟分別觀察肝組織超微結構變化，并采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應（real time polymerase chain reaction，real time-PCR）法檢測ADH2和ALDH2mRNA的表達。

1.3.3透射電鏡樣本的制備

第一，真誠。簡歷上“職業(yè)經(jīng)歷”這一欄，喬布斯讓它空著。當時沒有職業(yè)經(jīng)歷，所以他就沒寫，而不是像大多數(shù)人那樣，總要絞盡腦汁杜撰出幾個工作經(jīng)驗，而這種事要弄虛作假也確實輕而易舉。因此，從這點可以看出喬布斯的真誠。

小鼠處死后，于冰上取肝臟左葉中部，用雙面刀片切成1mm3大小，在4%戊二醛中固定24h后，取組織在室溫下于0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）配制的1g/100mL四氧化鋨酸固定2h，0.1mol/L PBS緩沖液清洗數(shù)次，然后分別用體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%丙酮各脫水一次，每次15min，接著用無水丙酮再脫水兩次，每次10min，脫水之后分別用1∶1（V/V）的丙酮樹脂混合液和1∶2（V/V）的丙酮樹脂混合液浸透1h，最后用純樹脂浸透2h，浸透之后將樣品放入包埋板中，立即加入包埋劑進行包埋，包埋之后將裝有樣品的包埋板依次放入30、45、60℃的聚合爐中聚合，聚合之后取出裝有樣品的包埋塊，修塊后進行半薄切片定位，用鉆石刀切成超薄切片并附到銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡進行觀察和拍照。

1.3.4Real time-PCR檢測酒精代謝相關基因的表達

目的基因的引物設計如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司使用美國PE公司391型DNA自動合成儀合成引物?？俁NA提取和檢測按Trizol試劑盒說明書進行，紫外分光及瓊脂糖電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。然后按AMV反轉(zhuǎn)錄酶和cDNA合成試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈蟛捎肦eal time-PCR檢測ADH2、ALDH2mRNA的表達，反應條件如下：95℃預變性120s；95℃，10s，60℃，40s，40個循環(huán)。反應結束后，每個標本設3個復孔，計算平均Ct值，每一次反應均設定陰性對照。采用2-ΔΔCt計算各目的基因相對反應起始拷貝數(shù)，以GAPDH基因為內(nèi)參。

表1　目的基因的引物設計Table1Primers for the target genes enes

1.4數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計方法用DPS13.50統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以表示。

2　結果與分析

2.1雞樅菌多糖對急性酒精肝損傷小鼠肝臟超微結構的影響

圖1　RPTA對急性酒精肝損傷小鼠肝臟超微結構的影響Fig.1Effect of RPTA on liver ultrastructure in mice

如圖1所示，電鏡下觀察空白對照組小鼠肝臟，其細胞形態(tài)規(guī)則，核膜完好無損，染色質(zhì)平均分布在核內(nèi)，核內(nèi)可見3個核仁，線粒體形狀規(guī)則，雙層膜及嵴清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整齊排列，可見豐富的核糖體顆粒在其上分布，無核糖體脫落及脂質(zhì)化現(xiàn)象。而造模后模型對照組小鼠肝臟細胞視野內(nèi)可見大量脂滴，細胞核呈不規(guī)則形態(tài)，核膜凹陷，線粒體變形嚴重，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核糖體顆粒脫落。而RPTA各劑量組小鼠肝臟較模型對照組癥狀有改善，其中以RPTA高劑量組小鼠肝臟最佳，其細胞趨于規(guī)則，無脂質(zhì)化出現(xiàn)，核膜完整，只有局部核膜呈不規(guī)則鋸齒狀，線粒體形狀基本恢復，有輕微的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹及核糖體脫落現(xiàn)象，可見線粒體嵴和雙層膜，結構基本接近藥物對照組水平；RPTA中劑量組小鼠肝臟細胞核呈不規(guī)則鋸齒狀，細胞質(zhì)內(nèi)可見少量不規(guī)則的線粒體存在，核膜凹凸不平，視野內(nèi)未見脂滴的存在，線粒體形狀基本趨于正常，其粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張現(xiàn)象較模型對照組明顯改善，有少量的核糖體脫落；RPTA低劑量組小鼠肝臟細胞視野內(nèi)還可見少量脂滴存在，局部核膜凹陷，呈不規(guī)則鋸齒狀，線粒體形狀趨于正?；?，線粒體嵴和其雙層膜模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張嚴重并見較多核糖體顆粒脫落，但較模型對照組已經(jīng)有一定程度的改善。

2.2RPTA對急性酒精肝損傷小鼠肝臟ADH2、ALDH2mRNA表達的影響

2.2.1Real time-PCR產(chǎn)物鑒定

由圖2可知，各產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，說明為單一片段擴增，熔解溫度分別為GAPDH為86.79℃（圖2A2），ADH2為87.85℃（圖2B2），ALDH2為89.47℃（圖2C2）。

圖2內(nèi)參基因GAPDHGAPDH（A）和目的基因ADH2ADH2（B）、BALDH2ALDH2（C）的C PCR擴增曲線及溶解曲線Fig.2Amplification curve and melting curve of reference（A），ADH2（B）and ALDH2（C）

2.2.2ADH2和ALDH2mRNA表達量

表2RPTA對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟AADDHH22、AALLDDHH22mmRRNNAA表達的影響（x±s，n==33）Table2Effect of RPTA on the mRNA expressionn ofcee（x ±s,, nn ==33）

表2RPTA對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟AADDHH22、AALLDDHH22mmRRNNAA表達的影響（x±s，n==33）Table2Effect of RPTA on the mRNA expressionn ofcee（x ±s,, nn ==33）

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同列大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.01）。

組別相對表達量ADH2mRNAALDH2mRNA空白對照組1.000±0.000aA1.000±0.000aA模型對照組0.141±0.001fE0.162±0.001eD藥物對照組0.946±0.005bB0.923±0.044bARPTA高劑量組0.918±0.004cB0.913±0.025bARPTA中劑量組0.734±0.014dC0.701±0.007cBRPTA低劑量組0.539±0.022eD0.429±0.018dC

以空白對照組為參照標準，由表2可知，造模后模型對照組小鼠ADH2和ALDH2的mRNA表達量顯著降低，RPTA劑量組小鼠肝臟的ADH2、ALDH2mRNA表達量較模型對照組增加，且隨著劑量的增加而增加，其中RPTA高劑量組小鼠肝臟ADH2、ALDH2mRNA表達量與藥物對照組無顯著差異（P＞0.01）。結果表明，RPTA能上調(diào)小鼠肝臟ADH2和ALDH2的mRNA表達量，從而改善急性酒精所導致的小鼠肝損傷情況。

3　討論

細胞核是細胞的控制中心，在細胞代謝、生長、分化中起著重要作用，是遺傳物質(zhì)的主要存在部位［22］，酒精在一定程度上能改變細胞核的結構，影響了細胞核本身遺傳信息的傳遞；線粒體是細胞質(zhì)中活細胞進行生物氧化產(chǎn)生能量的重要細胞器，糖、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)都是在線粒體內(nèi)ATP的參與下生成的，且有研究表明線粒體電子傳遞鏈提供細胞生命活動所需將近80%的能量［23］，酒精可通過改變線粒體的結構影響線粒體的功能，抑制氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)［24］。大部分中、長鏈脂肪酸均是通過線粒體β-氧化進行代謝，由于乙醛干擾三羧酸循環(huán)的正常進行，從而影響脂肪酸的β-氧化，阻礙蓄積脂肪酸的清除，最終形成脂肪肝［25］；而粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種，其膜表面有大量核糖體，在蛋白質(zhì)合成、加工及分泌過程中起著重要作用［26］，過量攝入酒精會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)整體功能紊亂，從而使得脂蛋白合成受到抑制，但甘油三酯的合成正常，脂肪不能運輸出去，引發(fā)脂肪堆積、沉積，出現(xiàn)脂滴［26］。小鼠電鏡超微結構顯示：模型對照組視野內(nèi)可見大量脂滴，小鼠肝細胞的細胞核變形，核膜不規(guī)則，線粒體變形嚴重，嵴模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹嚴重，核糖體脫落，提示酒精已經(jīng)導致肝細胞壞死，造模成功；而RPTA劑量組小鼠肝細胞中細胞核、線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雖然有不同程度的損傷，但是與模型對照組相比，已經(jīng)有很大程度的改善，尤其是RPTA高劑量組，視野內(nèi)基本不見脂滴的存在，小鼠細胞核形狀基本趨于正常，只有輕微的凹陷情況出現(xiàn)，線粒體嵴及雙層膜清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)只有輕微脫顆?，F(xiàn)象，與藥物對照組基本相當。

肝臟是體內(nèi)酒精代謝的主要器官，攝入體內(nèi)的乙醇90%以上在肝臟代謝，ADH2和ALDH2則是肝臟清除乙醇的兩種重要酶。研究［10，27］表明，ADH2、ALDH2mRNA的異常表達會導致乙醇代謝紊亂，而乙醇及其代謝產(chǎn)物和代謝過程中產(chǎn)生的代謝混亂是導致酒精性肝損傷的重要原因，當酒精攝入過量時，體內(nèi)代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂，導致酒精代謝異常，生成的乙醛無法完全被細胞防御體系所清除，殘留的乙醛會破壞核膜的完整性、斷裂粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、抑制線粒體呼吸鏈的電子傳遞，造成核膜凹陷、核糖體脫顆粒及線粒體能量生成障礙，進而影響細胞核、線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的改變。在本研究中Real time-PCR檢測ADH2和ALDH的mRNA表達，結果表明：造模后模型對照組ADH2、ALDH2mRNA表達量較空白對照組降低，提示造模成功；而RPTA各劑量組小鼠肝臟的ADH2和ALDH2mRNA表達量隨著劑量的增加而逐漸升高，其中高劑量組小鼠肝臟ADH2mRNA表達量與藥物對照組無顯著差異（P＞0.01），而其ALDH2mRNA表達量已經(jīng)達到藥物對照組水平，且無顯著性差異。提示RPTA可通過上調(diào)ADH2、ALDH2的mRNA表達，有效改善小鼠急性酒精肝損傷。

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Effects of Polysaccharides from Termitomyces albuminosus on Pathological Liver Ultrastructure and Gene Expression in Mice with Alcoholic Liver Injury

ZHAO Yunxia1，TAO Mingxuan1，*，CHENG Guangyu2，XING Jia1，LU Wenjuan1
（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing210097，China；2.College of Life Science，Nanjing Normal University，Nanjing210046，China）

Objective：The protective effect of refined polysaccharides from Termitomyces albuminosus （RPTA）on acute alcoholic hepatic injury in mice was investigated by electron microscopic examination and real-time PCR.Methods：The mice were randomly divided into blank control group，alcoholic control model group，bifendate（150mg/（kg·d）group and RPTA（100，200and400mg/（kg·d）groups.All the mice were administered with50%alcohol（12mL/kg）for30days except for those in blank control group.Twelve hours after alcohol treatment，all mice were executed to assay changes of hepatic ultrastructure，while the mRNA expression of ADH2and ALDH2in mice were analyzed by real-time PCR.Results：Comparing with the blank control group，we found that in the alcoholic model group there were accumulations of lipid droplets and glycogen and irregular nuclear membranes.Meanwhile，duplicative mitochondria were found injured and indistinct，and the endoplasmic reticulum was expanded as well as the ribosomes were dropped off.In contrast，in the RPTA treatment groups，the cardinal symptom gradually became better.Compared with the blank control group，the mRNA expression of ADH2and ALDH2in the model group revealed an obvious decrease，but in the RPTA treatment groups showed an increasing trend.Conclusion：RPTA plays an important role in protecting liver cells by promoting t he mRNA expression of ADH2and ALDH2.

Termitomyces albuminosus polysaccharidese；alcoholic hepatic injury；ultrastructure；alcohol dehydrogenase2；aldehyde dehydrogenase2；mRNA

TS201.4

A

1002-6630（2015）05-0195-05

10.7506/spkx1002-6630-201505037

2014-05-29

江蘇省高校自然科學基礎研究項目（10KJD550003）

趙云霞（1989—），女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)與保健功能因子。E-mail：xy4z@sina.com

陶明煊（1970—），男，副教授，碩士，研究方向為生物活性物質(zhì)與保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn