硫酸氨基葡萄糖對(duì)口服透明質(zhì)酸緩解小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的增效作用

杭興偉，增田泰伸，木村守，臼田美香，王　唯，陳　潔，張曉安，奚印慈，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.日本丘比株式會(huì)社，東京1500002）

硫酸氨基葡萄糖對(duì)口服透明質(zhì)酸緩解小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的增效作用

杭興偉1，增田泰伸2，木村守2，臼田美香2，王唯2，陳潔1，張曉安1，奚印慈1，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.日本丘比株式會(huì)社，東京1500002）

目的：探討硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）對(duì)口服透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）緩解小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的增效作用。方法：將50只8周齡ICR雄性小鼠隨機(jī)分成5組：正常組、模型組、HA組、GS組和HA+GS組。除正常組以外，其余4組小鼠左后足注射弗氏完全佐劑（freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA）建立佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，然后進(jìn)行4周的HA和GS口服給藥，并分別對(duì)小鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)小鼠血清中白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。結(jié)果：口服HA和GS都能夠減輕小鼠的足跖腫脹度，而同時(shí)口服HA和GS能起到更好的消腫效果，血清中IL-1及TNF-α的含量也顯著降低。結(jié)論：給予小鼠口服HA+GS，比單獨(dú)服用HA、GS能更有效、更快地緩解小鼠的足跖腫脹癥狀，同時(shí)能夠降低血清中IL-1及TNF-α含量，進(jìn)而對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎起到更好的治愈效果。

口服透明質(zhì)酸；口服硫酸氨基葡萄糖；佐劑性關(guān)節(jié)炎

關(guān)節(jié)炎是一種由于關(guān)節(jié)磨損退化而引起的慢性關(guān)節(jié)疾病，隨著年齡的增長(zhǎng)，其發(fā)病率會(huì)逐漸上升。關(guān)節(jié)炎患者通常會(huì)有關(guān)節(jié)組織水腫、關(guān)節(jié)僵硬、活動(dòng)受限等癥狀，他們的日常生活也因此受到了困擾。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，關(guān)節(jié)炎的病因主要與關(guān)節(jié)內(nèi)透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的降解有關(guān)，因此HA在關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制中的作用受到了廣泛關(guān)注［1］。

透明質(zhì)酸是存在于人體關(guān)節(jié)軟骨和滑液中的一種多糖成分，主要由關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌，在人體關(guān)節(jié)內(nèi)有一定的生理功能，有利于緩解關(guān)節(jié)炎癥狀［1］：1）關(guān)節(jié)液內(nèi)的HA具有黏彈性，能夠保護(hù)軟骨組織不受損，并對(duì)傷害性感受器的膜起到穩(wěn)定作用，減少疼痛感；2）HA在軟骨內(nèi)能夠形成一道屏障，抵擋炎性介質(zhì)侵入，防止組織受到破壞；3）滑膜內(nèi)HA含量的升高能對(duì)炎性細(xì)胞起到抑制作用，減輕滑膜炎癥。國(guó)內(nèi)已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道：口服透明質(zhì)酸能夠降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)，并通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)HA含量的升高，有效地緩解了關(guān)節(jié)炎癥狀［2］。目前，透明質(zhì)酸已經(jīng)被國(guó)家衛(wèi)生部認(rèn)定作為新資源食品的一種。

硫酸氨基葡萄糖（glucosamine sulfate，GS）作為一種天然活性物質(zhì)，主要存在于人體的結(jié)締組織和軟骨基質(zhì)中，是滑液中聚氨基葡萄糖的主要成分，在關(guān)節(jié)內(nèi)能夠發(fā)揮一定的生理功能，主要是刺激關(guān)節(jié)軟骨的蛋白聚糖合成及抑制其分解［3］。如今，硫酸氨基葡萄糖在醫(yī)藥及保健品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，相關(guān)專家已認(rèn)可并將其列為具有保健功能的健康食品之一；硫酸氨基葡萄糖于2000年被衛(wèi)生部門批準(zhǔn)為保健食品［4］。

國(guó)內(nèi)已有許多臨床實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道［5］，口服硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸能夠起到抑制關(guān)節(jié)炎惡化的效果，但由于關(guān)節(jié)內(nèi)注射HA在實(shí)際操作中不方便，長(zhǎng)期注射可能會(huì)給患者的關(guān)節(jié)造成一些負(fù)面影響，從而使患者產(chǎn)生畏懼感。因此，本研究以透明質(zhì)酸和硫酸氨基葡萄糖為材料，通過(guò)建立小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，探究在透明質(zhì)酸中加入硫酸氨基葡萄糖后，聯(lián)合口服二者對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎癥狀的緩解效果，并試圖為患者確立一種安全、便利、有效的聯(lián)合用藥新途徑。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、材料與試劑

ICR雄性小鼠50只，8周齡，體質(zhì)量約30g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；清潔級(jí)顆粒鼠糧、清潔級(jí)墊料江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

透明質(zhì)酸（相對(duì)分子質(zhì)量約為1.0×106，純度≥95%）日本丘比株式會(huì)社；硫酸氨基葡萄糖膠囊（維固力）羅達(dá)藥廠。

弗氏完全佐劑（freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA）美國(guó)Chondrex公司；乙醇、氯化鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

YP5002電子天平上海佑科有限公司；CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上海天美儀器有限公司；游標(biāo)卡尺杭州瑞騰精測(cè)食品有限公司；550型酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組與關(guān)節(jié)炎模型建立

ICR雄性小鼠50只分為5組，每組10只：正常組、模型組、HA組、GS組和HA+GS組。在恒溫條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由飲食、飲水。

將弗氏完全佐劑（FCA）和蒸餾水以1∶1（V/V）均勻混合后充分乳化，用1mL注射器吸取乳化好的FCA，然后分別對(duì)模型組、HA組、GS組以及HA+GS組小鼠左后足跖注射0.1mL FCA進(jìn)行關(guān)節(jié)炎造模，同時(shí)對(duì)正常組小鼠左后足跖注射等劑量的生理鹽水。

1.3.2透明質(zhì)酸與硫酸氨基葡萄糖的制備

透明質(zhì)酸（HA）的制備：將粉末狀的HA和蒸餾水混合，配制成質(zhì)量濃度為12mg/mL液體狀的HA，并通過(guò)磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的HA溶液，每天配制一次，現(xiàn)配現(xiàn)用。

硫酸氨基葡萄糖（GS）的制備：將粉末狀的GS和蒸餾水混合，配制成質(zhì)量濃度為6mg/mL液體狀的GS，并通過(guò)磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的GS溶液，每天配制一次，現(xiàn)配現(xiàn)用。

透明質(zhì)酸和硫酸氨基葡萄糖混合液（HA+GS）的制備：將粉末狀的HA和GS與蒸餾水混合，配制成每毫升含有12mg HA和6mg GS的混合液，并通過(guò)磁力攪拌器將其制備成性狀均勻的HA+GS混合溶液，每天配制一次，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3小鼠口服給藥處理

正常組：其余組小鼠造模后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL生理鹽水，每天一次，連續(xù)4周。模型組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL生理鹽水，每天一次，持續(xù)4周。HA組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL HA，每天一次，持續(xù)4周。GS組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL GS，每天一次，持續(xù)4周。HA+GS組：注射FCA后第2天，口服給予每只小鼠0.5mL HA+GS混合液，每天一次，持續(xù)4周。

1.3.4小鼠體質(zhì)量測(cè)定

在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，每天稱取小鼠體質(zhì)量，并做記錄。在適應(yīng)性飼養(yǎng)的最后一天，根據(jù)小鼠的體質(zhì)量，將其分為體質(zhì)量相近的5組進(jìn)行關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)期間，每天一次稱體質(zhì)量，記錄各組小鼠體質(zhì)量的變化情況。

1.3.5小鼠足跖腫脹度的測(cè)定

小鼠足坧腫脹度的測(cè)量：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前（即適應(yīng)性飼養(yǎng)的最后一天，計(jì)為第0天），在每只小鼠左、右足跖同一處做好標(biāo)記，在標(biāo)記處用游標(biāo)卡尺對(duì)足跖厚度和寬度進(jìn)行測(cè)量，并將測(cè)得的厚度和寬度相乘，即得到初始足跖腫脹度。每隔10d（第10、20、30天時(shí)）測(cè)量一次足跖腫脹度，并將第10、20、30天時(shí)測(cè)得的腫脹度數(shù)值與初始足跖腫脹度相減，即得到足跖腫脹度變化值。

圖像采集：在第30天，利用數(shù)碼相機(jī)對(duì)各組小鼠注射足的足跖部位進(jìn)行拍攝，并進(jìn)行組別間對(duì)比。

1.3.6血清中免疫學(xué)指標(biāo)的含量測(cè)定

5組小鼠按照1.3.3節(jié)方法口服給藥4周后，從小鼠背部大動(dòng)脈及心臟中取血置于無(wú)菌EP管中，5000r/min離心15min，取上清液，按照IL-1及TNF-αELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)（如果暫時(shí)不檢測(cè)，可將上清液移至另一無(wú)菌EP管中，-20℃保存待測(cè)）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)都采用SPSS20.0軟件處理，通過(guò)Tukey’s test進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果均以±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠的一般影響

模型組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠在注射FCA后，左足跖都出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，與正常組小鼠相比，行動(dòng)變得遲緩，飲食略微減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)也開(kāi)始減緩。其中，模型組小鼠的左足跖腫脹現(xiàn)象不斷惡化，而HA組、GS組和HA+GS組小鼠在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的口服給藥之后，左足跖及腳踝的腫脹情況得到了不同程度的緩解，飲食、體質(zhì)量等各項(xiàng)指標(biāo)都得到了有效改善。

2.2口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠體質(zhì)量變化的影響

圖1　口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1Effect of HA and GS on body weight in mice with adjuvant arthritis

如圖1所示，各組小鼠經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，基本都保持在同一生長(zhǎng)狀態(tài)，因此各組小鼠的初始體質(zhì)量變化為0，之后建立模型并對(duì)各組小鼠口服給藥，此時(shí)計(jì)為第0天，觀察給藥28d內(nèi)各組小鼠體質(zhì)量的變化情況。在0～7d內(nèi)，模型組小鼠體質(zhì)量差值出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，并且與HA組、GS組、HA+GS組存在顯著差異（P＜0.05），這可能是由于關(guān)節(jié)炎給小鼠帶來(lái)疼痛感，從而極大地影響了它們的生長(zhǎng)狀態(tài)，導(dǎo)致體質(zhì)量有略微下降；而正常組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠體質(zhì)量差值都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中HA、GS和HA+GS組小鼠雖然患有關(guān)節(jié)炎癥，但體質(zhì)量并未下降，這可能是由于這3組小鼠經(jīng)過(guò)藥物治療后，炎癥得到了一定緩解的作用，從而使體質(zhì)量呈現(xiàn)緩慢的增長(zhǎng)趨勢(shì)，但增長(zhǎng)的速率略低于正常組。

在7～28d內(nèi)，HA組、GS組和HA+GS組小鼠體質(zhì)量始終保持著持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)，而HA+GS組小鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)速率略高于HA組和GS組，但并未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。在14～28d內(nèi)，模型組小鼠體質(zhì)量也呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，并且與HA組、GS組不存在顯著差異（P＞0.05）。從食用飼料的情況來(lái)看，模型組、HA組、GS組和HA+GS組小鼠的食用量相近（模型組914.97g、HA組993.96g、GS組988.47g、HA+GS組980.6g）。而在7～28d內(nèi)，各組小鼠體質(zhì)量都有明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，這在一定程度上可以說(shuō)明飼料的食用情況并未對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)產(chǎn)生較大影響，在給藥期間的大部分時(shí)間內(nèi)，各組小鼠體質(zhì)量都保持著增長(zhǎng)的狀態(tài)。

2.3口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度的影響

圖2口服給藥28d后各組佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠左足跖的腫脹情況Fig.2Swelling status of the left paw mice with adjuvant arthritis after oral administration for28days

如圖2所示，通過(guò)圖像采集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠左足跖腫脹情況最為顯著。與模型組相比，HA組、GS組和HA+GS組則有不同程度的消腫跡象；與HA組和GS組比較，在HA中加入GS后（HA+GS組）給予小鼠口服的效果更為明顯。

圖3口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠左足跖腫脹度的影響Fig.3Effect of HA and GS on the swelling degree of the left paw in mice with adjuvant arthritis

圖4口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠右足跖腫脹度的影響Fig.4Effect of HA and GS on the swelling degree of the right paw in mice with adjuvant arthritis

如圖3所示，將適應(yīng)性飼養(yǎng)的最后一天計(jì)為第0天，在第10天，模型組、HA組、GS和HA+GS組小鼠的左足跖都出現(xiàn)明顯的腫脹現(xiàn)象，其中模型組最為顯著，左足跖腫脹度變化值顯著高于HA組、GS組和HA+GS組（P＜0.05），這表明小鼠在注射了FCA后，其左足跖產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)。如圖4所示，模型組小鼠右足跖的腫脹度也有一定程度的增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)趨勢(shì)較為緩慢，到第30天時(shí)，模型組與HA組、GS組和HA+GS組間相比表現(xiàn)出一定的差異，但與左足跖相比，腫脹度的變化并不明顯。在注射FCA后的第20天，模型組小鼠的左足跖腫脹度變化值達(dá)到峰值，而HA組、GS組和HA+GS組小鼠左足跖腫脹度則呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，其中HA+GS組小鼠左足跖的腫脹度變化值低于HA組和GS組，且與HA組比較，存在顯著差異（P＜0.05）。而HA組、GS組和HA+GS組與模型組之間也都存在顯著差異（P＜0.05）。到第30天，模型組小鼠左足跖出現(xiàn)略微的消腫現(xiàn)象，而HA組、GS組和HA+GS組的左足跖腫脹度變化值則繼續(xù)減小，其中HA+GS組最為明顯，腫脹度變化值遠(yuǎn)低于HA組和GS組，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

在HA中加入GS后，給予小鼠口服4周內(nèi)，HA+GS組小鼠左足跖腫脹度變化值始終低于HA組和GS組，且腫脹度的減小速率大于這兩組，并在第20天時(shí)就表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。而HA組和GS組小鼠左足跖腫脹度變化值的減小速率相近，且二者之間不存在顯著差異（P＞0.05）。2.4口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠血清中IL-1含量的影響連續(xù)口服給藥4周后，對(duì)各組小鼠血清中IL-1的含量進(jìn)行檢測(cè)，觀察各組之間的差異。如圖5所示，模型組小鼠血清中IL-1的含量與正常組相比顯著升高，HA組、

圖5口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠血清中IL-1含量的影響Fig.5Effect of oral administration of HA and/or GS by on serum IL-1level in mice with adjuvant arthritis

GS組和HA+GS組小鼠在口服HA和GS后，血清中IL-1

的含量都明顯降低，且與模型組相比，都存在顯著差異（P＜0.05）。其中HA+GS組表現(xiàn)更為明顯，與HA組比較，存在顯著差異（P＜0.05）。以正常組為基準(zhǔn)，計(jì)算其余4組IL-1含量的增長(zhǎng)率：模型組為156.23%、HA組為

57.79%、GS組為53.00%、HA+GS組為27.51%。

2.5口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠血清中TNF-α含

量的影響

圖6口服HA和GS對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠血清中TNF-TNF-α含量的影響Fig.6Effect of oral administration of HA and/or GS by on serum TNF-αlevel in mice with adjuvant arthritis

經(jīng)過(guò)4周的口服給藥后，檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α的含量，比較各組之間的差異。如圖6所示，模型組小鼠血清中TNF-α的含量與正常組相比顯著升高，HA、GS和HA+GS組小鼠在口服HA和GS后，血清中TNF-α的含量都明顯降低，且與模型組相比都存在顯著差異（P＜0.05）。其中HA+GS組最為顯著，與其余3組之間存在顯著差異（P＜0.05）。

3　結(jié)論與討論

透明質(zhì)酸是構(gòu)成人體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨和滑液的主要成分，是由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖構(gòu)成的雙糖單位連接而成的高分子黏性多糖。它在人體關(guān)節(jié)內(nèi)能起到保護(hù)軟骨以及合成滑膜內(nèi)HA的作用［6］。而硫酸氨基葡萄糖是存在于機(jī)體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨中的氨基單糖。據(jù)報(bào)道，GS所產(chǎn)生的無(wú)機(jī)硫酸基團(tuán)可以控制多聚氨基葡萄糖和蛋白多糖的合成，從而保護(hù)和修復(fù)受損的軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞［7］；另外，補(bǔ)充外源性的硫酸氨基葡萄糖還可以調(diào)節(jié)膠原酶和磷脂酶A2的活性，減少損傷軟骨細(xì)胞的內(nèi)毒性因子釋放，對(duì)軟骨內(nèi)多聚氨基葡萄糖的代謝起到促進(jìn)和平衡的作用。

在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理過(guò)程中，IL-1被認(rèn)為是最核心的炎癥因子，它的表達(dá)程度與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-1可通過(guò)不同途徑引起關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞及降解：1）IL-1對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的異常調(diào)控是導(dǎo)致軟骨破壞的主要途徑之一，MMPs對(duì)軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖都具有高度的裂解活性，能夠降解軟骨外基質(zhì)，進(jìn)而破壞軟骨組織［8］；2）在滑膜細(xì)胞中，IL-1的表達(dá)增加，對(duì)滑膜炎癥起著促進(jìn)作用，進(jìn)一步增加了炎癥因子以及MMPs的產(chǎn)生，從而破壞軟骨組織，加速關(guān)節(jié)炎的發(fā)展；3）刺激TNF-α、一氧化氮等炎癥因子的高度表達(dá)，加劇軟骨細(xì)胞的凋亡，并且IL-1與TNF-α之間有著協(xié)同作用，共同促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌纖維蛋白溶酶原激活劑，使纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)換成纖維蛋白溶酶而降解纖維蛋白，加速膠原的分解代謝，這些均可造成軟骨的損傷［9-11］。所以IL-1和TNF-α可作為評(píng)判關(guān)節(jié)炎病情的重要指標(biāo)。已有實(shí)驗(yàn)研究證明［12-15］，關(guān)節(jié)炎患者血清中IL-1和TNF-α的含量明顯高于健康人群。因此通過(guò)測(cè)定血清中IL-1和TNF-α的含量，可以初步判斷關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。而本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)模型組小鼠血清中IL-1和TNF-α的含量遠(yuǎn)高于正常組。

經(jīng)過(guò)口服外源性透明質(zhì)酸后，HA會(huì)與小腸上皮細(xì)胞中HA接收器Toll樣受體-4（toll-like receptor-4，TLR-4）結(jié)合，刺激細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）的表達(dá)，通過(guò)SOCS3的引導(dǎo)，產(chǎn)生抑炎癥因子IL-10，抑制IL-1的表達(dá)；IL-10作為重要的抗炎Th2型細(xì)胞因子，能夠通過(guò)抑制核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）進(jìn)而抑制TH1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，控制其對(duì)軟骨的破壞［16-17］。另外，HA本身具有清除關(guān)節(jié)滑液內(nèi)自由基的功能，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬作用及白細(xì)胞趨化性，從而抑制關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng)，阻止關(guān)節(jié)軟骨的退化［18-21］。

硫酸氨基葡萄糖作為一種小分子化合物，口服之后，在小腸中被分解為氨基葡萄糖和硫酸根離子。硫酸根離子對(duì)軟骨中蛋白多糖的合成能起到一定的作用；同時(shí)氨基葡萄糖能通過(guò)載體擴(kuò)散進(jìn)入軟骨細(xì)胞，抑制與IL-1調(diào)控的相關(guān)酶，從而下調(diào)IL-1的表達(dá)；由于IL-1與TNF-α之間有著協(xié)同作用，IL-1的表達(dá)下降在一定程度上也導(dǎo)致TNF-α的表達(dá)降低，進(jìn)而減緩炎癥的惡化［22］。而在軟骨表面，GS還有阻斷與IL-1表達(dá)相關(guān)的信號(hào)途徑的作用，主要是抑制NF-κB的活性，同時(shí)促進(jìn)非活性的IL-1受體，使之與IL-1相結(jié)合，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生炎癥效應(yīng)［22］。國(guó)外已有研究報(bào)道［23］，關(guān)節(jié)炎發(fā)生會(huì)導(dǎo)致軟骨內(nèi)蛋白多糖的含量減少。從理論上說(shuō)，口服外源性GS能夠刺激關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)蛋白聚糖的合成，并且抑制某些破壞軟骨的酶的產(chǎn)生，從而下調(diào)TNF-α的表達(dá)［24］。但具體機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)，有待進(jìn)一步研究論證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GS組小鼠血清中IL-1以及TNF-α的含量遠(yuǎn)低于模型組，且它們之間存在顯著差異（P＜0.05）。

在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠作為研究對(duì)象，由于其個(gè)體過(guò)小，一部分關(guān)節(jié)測(cè)量的效果并不十分明顯，但通過(guò)分析小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)給予HA或GS都能對(duì)關(guān)節(jié)炎癥狀起到一定的緩解效果，但它們之間不存在顯著性差異（P＞0.05），這說(shuō)明，單獨(dú)口服HA或GS，對(duì)關(guān)節(jié)炎癥狀的緩解有著相似的效果。在HA中加入GS后給予小鼠口服，不僅使HA在小鼠小腸內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，下調(diào)炎性介質(zhì)的表達(dá)，而且還保留了HA在關(guān)節(jié)內(nèi)的生理功能，抑制炎癥的進(jìn)一步惡化；同時(shí)GS通過(guò)小腸分解，形成硫酸根離子和氨基葡萄糖，在軟骨表面發(fā)揮不同的作用，硫酸根離子能促進(jìn)蛋白多糖的合成，起到穩(wěn)定軟骨組織結(jié)構(gòu)的作用。而氨基葡萄糖則協(xié)同HA抑制炎癥因子的高度表達(dá)，對(duì)軟骨進(jìn)行有效保護(hù)，促進(jìn)緩解炎癥，有效地抑制了軟骨退化。已有很多臨床研究報(bào)道［25-30］，采用口服硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸對(duì)關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行治療，結(jié)果在各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)中都得到了良好的效果，并且優(yōu)于單獨(dú)口服GS或關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射HA，同時(shí)兩者聯(lián)合治療的療效持久、治愈率高；但關(guān)節(jié)注射可能會(huì)給患者帶來(lái)不必要的疼痛，使患者產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)。因此在本次研究中，通過(guò)口服的方式，將GS添加到HA中，給予小鼠食用，結(jié)果對(duì)足跖腫脹度差值結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)：在口服HA和GS后的第20天，HA+GS組就與HA組有顯著性差異，而到了第30天與HA組和GS組都存在差異（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：GS加快了HA緩解關(guān)節(jié)炎癥狀的作用，并增強(qiáng)了這種療效的持久性。

給小鼠單獨(dú)口服HA和GS，在一定程度上能夠緩解其關(guān)節(jié)炎癥狀。而在HA中添加GS后給小鼠口服，不僅保留了HA抑制關(guān)節(jié)炎癥的功能特性，同時(shí)還發(fā)揮了GS對(duì)軟骨的保護(hù)作用，更有效地減輕了小鼠足跖腫脹度以及降低了相關(guān)炎癥因子IL-1及TNF-α的含量，對(duì)關(guān)節(jié)炎起到了更為顯著的治愈效果。

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Synergism of Glucosamine Sulfate in Relieving Effect of Hyaluronic Acid by Oral Administration on Mice with Adjuvant Arthritis

HANG Xingwei1，YASUNOBU Masuda2，MAMORU Kimura2，MIKA Usuda2，WANG Wei2，CHEN Jie1，ZHANG Xiaoan1，XI Yinci1，*
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China；2.Japan Kewpie Corporation，Tokyo1500002，Japan）

Aim：To explore the synergism of glucosamine sulfate（GS）with hyaluronic acid（HA）by oral administration in relieving adjuvant arthritis in mice with.Methods：Fifty8-week-old ICR male mice were randomly divided into5groups at random with an equal number of animals in each group：normal，model，HA，GS，and HA+GS groups.Except normal group，the animal models with adjuvant arthritis from4other groups were established by injecting0.1mL of Freund’s complete adjuvant（FCA）into the left rear paw，followed by oral administration of HA and/or GS for4weeks.The body weights and swelling degree of mouse rear feet were evaluated respectively.The serum concentration of IL-1and TNF-α in mice were detected by enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）.Results：Swelling degree of mouse feet could be inhibited by oral administration of HA or GS，and this inhibitory effect was more pronounced when both compounds were administrated.In addition，an obvious decrease in IL-1and TNF-αlevels in serum was observed.Conclusion：In addition to decreasing serum IL-1and TNF-αlevels，HA and GS could alleviate the swelling of mouse feet more effectively and rapidly when used in combination than when used individually，so that exerting a better curative effect on mouse arthritis.

oral administration of hyaluronic acid；oral administration of glucosamine sulfate；adjuvant arthritis

TS201.2

A

1002-6630（2015）05-0189-06

10.7506/spkx1002-6630-201505036

2014-07-01

上海海洋大學(xué)-日本丘比株式會(huì)社合作研究基金項(xiàng)目

杭興偉（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊晃镔|(zhì)對(duì)關(guān)節(jié)炎的療效。E-mail：Strongb@126.com

奚印慈（1957—），女，博士，研究方向?yàn)樘烊晃镔|(zhì)的生物活性。E-mail：ycxi@shou.edu.com