花椒精對卵巢切除大鼠脂質(zhì)代謝的影響

游玉明，任文瑾，劉慶慶，劉雄，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶402160）

花椒精對卵巢切除大鼠脂質(zhì)代謝的影響

游玉明1，2，任文瑾1，劉慶慶1，劉雄1，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶402160）

目的：探討花椒精對卵巢切除大鼠脂質(zhì)代謝的影響。方法：將40只雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為5組，其中1組進行偽切除手術(shù)（Sham）作為對照組，另外4組進行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)（ovariectomy，OVX），恢復飼喂一周后，分為空白組和灌胃花椒精高（15mg/kg）、中（10mg/kg）、低（5mg/kg）劑量組。灌胃4周后解剖，檢測大鼠血脂、肝脂及小腸和糞便中膽汁酸含量等指標。結(jié)果：灌胃花椒精可降低血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-high density lipoprotein cholesterol，non-HDL-C）的濃度（P＜0.05），升高HDL-C的濃度；降低肝臟中脂肪、TC、TG的含量（P＜0.05）；增加大鼠排便量、促進小腸內(nèi)容物和糞便中膽汁酸以及糞醇、膽固醇等中性固醇的排泄，且存在明顯的劑量效應。結(jié)論：花椒精可改善卵巢切除SD大鼠因雌性激素缺乏而引起的高脂血癥，可能與促進膽汁酸和中性固醇的排泄有關(guān)。

花椒精；卵巢切除大鼠；血脂；膽汁酸；中性固醇Abstract: Objective：To investigate the effect of oleoresin from Zanthoxylum bungeanum on lipid me tabolism in ovariectomized rats.Methods：Forty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups；one group was sham-operated as sham control，and the other four groups were subjected to ovariectomy.After one week of feeding postsurgery，the rats from the sham control and ovariectomy groups were daily orally administered with0，15（OVX-HD），10（OVX-MD），and5mg/kg（OVX-LD） Zanthoxylum bungeanum oleoresin.After fo ur weeks，all the rats were sacrificed for the analysis of triglyceride（TG），cholesterol（TC）in serum and liver，bile acids in small intestine and feces.Results：By the administration of Zanthoxylum bungeanum oleoresin，the concentrations of triglyceride，cholesterol，low-density lipoprotein cholesterol and non high-density lipoprotein cholesterol in serum were significantly decreased（P <0.05）as well as the concentrations of fat，triglyceride and cholesterol in liver，but the excretion of fec es，bile acid contents in small intestine and feces，and the excretion of neutral steroids were increased.Conclusion： Zanthoxylum bungeanum oleoresin can ameliorate lipid metabolism in estrogen deficiency-induced hypercholesterolemia rats by promoting the excretion of bile acids and neutral steroids.

女性進入更年期后，由于雌性激素缺乏引起植物神經(jīng)功能紊亂，從而導致體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，進而引發(fā)高脂血癥、高血壓、心血管疾病等癥狀，對更年期女性健康和生活質(zhì)量的影響日趨嚴重，成為更年期女性不容忽視的重要健康問題［1-3］。目前，針對雌性激素缺乏主要的治療方式是采用激素替代療法，效果較好但副作用大，可能會導致乳腺癌、子宮癌和陰道出血等不良癥狀［4-5］。通過膳食預防和調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂是一條理想的途徑。

花椒為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum L.）植物，廣泛分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國是世界上花椒種植面積和產(chǎn)量最大的國家［6-7］。花椒精是花椒果殼經(jīng)適當溶劑萃取、濃縮所得的稠狀液體，其主要成分為花椒揮發(fā)油和花椒麻素。前期研究表明，灌胃花椒精后，卵巢切除大鼠盲腸內(nèi)容物中游離氨濃度下降，盲腸中有害菌的數(shù)量減少，短鏈脂肪酸的濃度增加，有效改善了腸道內(nèi)環(huán)境［8］。許多研究表明，腸道內(nèi)環(huán)境與體內(nèi)脂質(zhì)的代謝密切相關(guān)［9-11］，腸道中微生物可通過調(diào)控禁食誘導脂肪細胞因子（Fiaf）的表達而影響甘油三酯在脂肪細胞的儲存［12-13］，其發(fā)酵所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以刺激肝臟脂肪代謝相關(guān)的酶，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝［14］。那么花椒精是否對因雌性激素缺乏而導致的高脂血癥大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝亦有改善作用尚有待研究。本實驗采用卵巢切除大鼠模擬更年期女性雌性激素缺乏模型，探討花椒精對卵巢切除大鼠脂質(zhì)代謝的影響，以期為花椒的高值化利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質(zhì)量為90～110g）、基礎(chǔ)飼料均購自重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司，動物許可號：SCXK（渝）2007-008。

花椒精（其主要成分花椒揮發(fā)油及花椒麻素含量分別為54.64%、32.18%），購自重慶市驕王花椒股份有限公司。

血清總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）測定試劑盒四川邁克生物科技股份有限公司；總膽汁酸測定試劑盒上海豐翔生物科技有限公司；5α-膽甾烷、膽固醇、糞醇美國Sigma公司；其他均為常用生化試劑或分析純試劑。1.2儀器與設(shè)備

7020型全自動生化分析儀日本株式會社日立制作所；Imark酶標儀美國Bio-Rad公司；GC-2010氣相色譜儀日本島津公司；ALPHA1-4型真空冷凍干燥機、RVC2-33IR型真空離心濃縮儀德國Christ公司；RM2235切片機德國Leica公司；H550L型高分辨率數(shù)碼成像系統(tǒng)日本尼康株式會社。

1.3方法

1.3.1動物飼養(yǎng)

40只雌性SD大鼠，保持室溫（25±1）℃，12h明暗輪換（9：00—21：00），適應喂養(yǎng)1周后，腹部注射戊巴比妥鈉（30mg/kg）使其麻醉，隨機抽取32只大鼠進行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)（ovariectomy，OVX），另外8只進行偽切除手術(shù)（Sham）。手術(shù)后恢復飼喂1周，將OVX大鼠隨機分為空白組、花椒精高劑量組（15mg/kg）、花椒精中劑量組（10mg/kg）、花椒精低劑量組（5mg/kg）；Sham組和空白組灌胃相同劑量大豆油。所有大鼠均喂食基礎(chǔ)飼料，自由攝食和飲水，實驗周期為4周。

1.3.2樣品收集

收集大鼠解剖前4d的糞便，真空冷凍干燥后稱質(zhì)量、粉碎后置于塑料袋中在干燥環(huán)境中貯存，用于糞便中膽汁酸和中性膽固醇含量的測定。

實驗期最后1d禁食12h，乙醚麻醉后將大鼠斷頭處死，血液收集在裝有抗凝劑的采血管中，4℃、4000r/min離心15min，血清分裝在微型離心管中并貯存于-20℃冰箱。

收集完血液后，肝臟經(jīng)4℃預冷的生理鹽水灌流1min后摘除，經(jīng)預冷的生理鹽水洗去表面血水后用吸濕紙除去表面水滴，稱質(zhì)量后再取1.00g肝臟用錫箔紙包好后放入樣品袋，貯存于-20℃冰箱，用于肝脂含量的測定；再選取肝臟中部較規(guī)則部分，用刀片切取0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方體組織，置于事先配制好的波恩氏（Bouins）固定液中固定，用于制作肝臟組織的石蠟切片。

取出小腸，用25mL預冷的生理鹽水沖洗小腸內(nèi)容物至預先稱質(zhì)量的離心管中，真空冷凍干燥后用于小腸內(nèi)容物中膽汁酸含量的測定。

1.3.3檢測指標

1.3.3.1血脂和肝脂含量的測定

血清TC、TG、HDL-C及LDL-C含量使用相關(guān)試劑盒檢測。肝臟中總脂肪采用Folch等［15］的方法提取，用質(zhì)量差法測定總脂肪含量，同時使用試劑盒測定抽提液中TC和TG的含量。

1.3.3.2糞便和小腸內(nèi)容物總膽汁酸含量的測定

采用3α-固醇脫氫酶法，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3.3糞便中性固醇含量的測定

參考Kato等［16］的方法。取0.05g粉碎后的樣品于帶螺旋密封蓋的試管中，加入氯仿-甲醇（1∶1，V/V）的混合溶劑5mL，在60℃恒溫水浴中抽提18h。取抽提液2.5mL于離心管中，加入0.01mol/L5α-膽甾烷甲醇溶液100μL作為內(nèi)標物，真空離心脫除溶劑；加入100μL甲醇溶解，然后加入2mL5mol/L NaOH溶液，充分混勻后，放入120℃高壓殺菌鍋中處理4h。待處理液冷卻后，加入3mL沸程為30～60℃石油醚混合均勻后，4℃、4000r/min離心5min，移出上層溶液，下層溶液重復萃取2次，合并上層萃取液，萃取液脫溶劑后加入1mL乙酸乙酯，充分溶解后，采用氣相色譜（gas chromatography，GC）測定中性固醇含量。

GC條件：色譜柱為DB-1毛細管柱（30m× 0.53mm，0.32μm），載氣流速16.9mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣，柱溫箱260℃，F(xiàn)ID檢測器，進樣口及檢測器溫度為280℃。

1.3.3.4肝臟切片染色觀察

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法。肝臟經(jīng)固定、脫水、透明及石蠟包埋后，制成5 μm厚的切片，經(jīng)HE染色處理后采用高分辨率數(shù)碼成像系統(tǒng)觀察切片并拍照。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1花椒精對卵巢切除大鼠血脂水平的影響

表1　花椒精對卵巢切除大鼠血脂水平的影響（Table1Effectt ooff Zanthoxylum bungeannuumm oleoresin on serum liippiidd levels in of OVX raattss

表1　花椒精對卵巢切除大鼠血脂水平的影響（Table1Effectt ooff Zanthoxylum bungeannuumm oleoresin on serum liippiidd levels in of OVX raattss

注：*.OVX空白組與Sham組相比存在顯著差異（P＜0.05）；同行小寫字母不同表示OVX各組間相比存在顯著差異（P＜0.05）。下同。

指標Sham組OVX空白組花椒精低劑量組花椒精中劑量組花椒精高劑量組TC濃度/（mmol/L）1.85±0.162.51±0.31*a2.24±0.22ab2.15±0.27bc2.20±0.24bTG濃度/（mmol/L）0.46±0.070.57±0.16*a0.52±0.15a0.46±0.14b0.39±0.06bcHDL-C濃度/（mmol/L）0.52±0.050.52±0.08a0.57±0.09ab0.58±0.10ab0.60±0.10bLDL-C濃度/（mmol/L）0.12±0.020.18±0.02*a0.12±0.01b0.13±0.02ab0.12±0.02bnon-HDL-C濃度/（mmol/L）1.41±0.201.87±0.20*a1.75±0.16a1.67±0.14ab1.56±0.12b

由表1可知，與Sham組相比，OVX空白組大鼠血漿中TC、TG和LDL-C濃度都顯著上升（P＜0.05），而HDL-C濃度無顯著性變化，說明雌激素缺乏誘發(fā)大鼠產(chǎn)生了高脂血癥。在OVX各組中，花椒精高劑量組大鼠的TC、TG、LDL-C和non-HDL-C濃度與空白組相比分別降低了12.35%、31.58%、33.33%和16.58%（P＜0.05），且HDL-C濃度顯著增加（P＜0.05）；花椒精中劑量組的TC、TG濃度顯著低于空白組（P＜0.05），而其余指標無顯著差異，但LDL-C濃度有降低趨勢，HDL-C濃度有升高趨勢；低劑量組除LDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）外，其余指標無顯著性變化，但其TC、TG濃度有下降趨勢，HDL-C濃度有升高趨勢。由此可知，不同劑量的花椒精對雌激素缺乏引起的高脂血癥均有預防效果，且呈現(xiàn)劑量效應。

2.2花椒精對卵巢切除大鼠肝脂水平的影響

由表2可知，大鼠灌胃花椒精以及卵巢切除后對肝臟質(zhì)量無顯著性影響。與Sham組相比，卵巢切除對大鼠的肝臟脂肪含量及肝臟總脂肪含量沒有顯著影響，但OVX空白組大鼠肝臟中TC含量、TC總量以及TG含量顯著上升（P＜0.05），而灌胃中、高劑量花椒精可以顯著降低大鼠肝臟中TC含量和總量（P＜0.05），花椒精低劑量組的大鼠肝臟TC總量也顯著降低（P＜0.05），TC含量有降低趨勢；中、高劑量的花椒精可以顯著降低大鼠肝臟中TG的含量（P＜0.05），但各組間肝臟TG總量沒有顯著差異。因此，花椒精能夠有效抑制卵巢切除引起的大鼠肝臟脂質(zhì)含量升高，這種效果呈劑量正相關(guān)，以花椒精中、高劑量組最為顯著。

表2花椒精對卵巢切除大鼠肝脂水平的影響Table2Effectt ooff Zanthoxylum bungeaannuumm oleoresin on hepatic liippiidd level in OVX raattss

表2花椒精對卵巢切除大鼠肝脂水平的影響Table2Effectt ooff Zanthoxylum bungeaannuumm oleoresin on hepatic liippiidd level in OVX raattss

指標Sham組OVX空白組花椒精低劑量組花椒精中劑量組花椒精高劑量組肝臟質(zhì)量/g7.79±1.388.89±1.538.83±0.778.75±1.048.59±1.11肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量0.027±0.0040.027±0.0020.027±0.0010.027±0.0020.027±0.003總脂肪含量/g0.47±0.110.51±0.07a0.47±0.08ab0.46±0.06ab0.42±0.08b脂肪含量/（g/g）0.06±0.010.06±0.01a0.06±0.01ab0.05±0.01ab0.05±0.00bTC總量/μmol69.29±5.3296.43±4.86*a88.01±3.68b79.09±3.86bc67.22±3.33cTC含量/（μmol/g）8.86±0.8910.76±0.57*a9.97±0.50ab9.16±0.54b7.76±0.89bcTG總量/?mol38.96±22.9539.70±14.9739.27±12.6037.34±14.5934.86±19.54 TG含量/（μmol/g）3.97±2.284.85±1.74*a4.76±1.70a4.55±1.87b4.50±1.39bc

2.3花椒精對卵巢切除大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

圖1　花椒精對卵巢切除大鼠肝臟組織形態(tài)的影響Fig.1Effect of Zanthoxylum bungeanum oleoresin on hepatic histology in OVX rats

如圖1所示，與Sham組相比，OVX空白組大鼠肝臟組織出現(xiàn)脂肪滴沉積，但無明顯的炎性細胞浸潤，未見纖維化形成，也未觀察到明顯的局部性肝細胞壞死或細胞凋亡等現(xiàn)象，表明卵巢切除可以引起典型的脂肪肝形成。而灌胃花椒精能有效降低肝臟中脂肪空泡的形成，有效緩解脂肪肝，其中花椒精低劑量組大鼠肝臟組織可見少量脂肪滴，但脂肪泡的體積較空白組小的多，花椒精中劑量改善效果更強，花椒精高劑量組大鼠肝臟未見明顯的脂肪滴沉積，與Sham組大鼠肝臟組織形態(tài)非常接近，肝細胞大小形態(tài)正常，細胞界限清晰。

2.4花椒精對卵巢切除大鼠小腸內(nèi)容物及糞便中總膽汁酸含量的影響由表3可知，卵巢切除可以提高大鼠排便量，但與

表3花椒精對卵巢切除大鼠糞便和小腸內(nèi)容物總膽汁酸含量的影響Table3Effectt of Zanthoxylum bu ngeanumm oleoresin on bile acid level in feces and small intestine contents in

表3花椒精對卵巢切除大鼠糞便和小腸內(nèi)容物總膽汁酸含量的影響Table3Effectt of Zanthoxylum bu ngeanumm oleoresin on bile acid level in feces and small intestine contents in

花椒精高劑量組糞便總質(zhì)量/（g/d）3.64±0.224.08±0.32a4.37±0.17ab4.35±0.21ab4.93±0.34b總膽汁酸含量/（μmol/d）73.30±5.8954.05±4.51*a95.58±4.64b92.04±5.58b114.81±4.52c膽汁酸含量/（μmol/g）20.12±0.2113.27±0.32*a21.77±0.28b21.19±0.24b23.31±0.21bc小腸內(nèi)容物總質(zhì)量/g0.39±0.010.41±0.020.40±0.010.42±0.020.42±0.01總膽汁酸含量/（μmol/d）2.54±0.112.36±0.08a2.57±0.12a2.61±0.14ab2.83±0.12b指標Sham組OVX空白組花椒精低劑量組花椒精中劑量組

Sham組相比無顯著差異，灌胃高劑量的花椒精能顯著增加OVX大鼠的排便量（P＜0.05），低、中劑量組大鼠排便量也比空白組有所增加，但無顯著差異。而卵巢切除和灌胃花椒精均未對大鼠小腸內(nèi)容物質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響。與Sham組相比，OVX空白組大鼠糞便中總膽汁酸和膽汁酸含量都顯著降低（P＜0.05），小腸內(nèi)容物中總膽汁酸含量有降低趨勢，但未達到顯著性。灌胃花椒精可以顯著提高卵巢切除大鼠糞便中總膽汁酸和膽汁酸的含量（P＜0.05），且花椒精高劑量組大鼠糞便總膽汁酸含量達到了顯著水平（P＜0.05），比空白組增加了

112.44%；灌胃高劑量的花椒精能夠顯著增加大鼠小腸內(nèi)容物中總膽汁酸的含量（P＜0.05），花椒精低、中劑量組也有增加趨勢，但無顯著差異。

2.5花椒精對卵巢切除大鼠糞便中性固醇含量的影響

表4　花椒精對卵巢切除大鼠糞便中性固醇含量的影響Table4Effectt ooff Zanthoxylum bungeaannuumm oleoresin on neutral sterrooiidd level in feces of OVX raattss

表4　花椒精對卵巢切除大鼠糞便中性固醇含量的影響Table4Effectt ooff Zanthoxylum bungeaannuumm oleoresin on neutral sterrooiidd level in feces of OVX raattss

指標Sham組OVX空白組花椒精低劑量組花椒精中劑量組花椒精高劑量組糞醇含量/（mg/d）0.88±0.030.67±0.01*a0.72±0.02a0.89±0.01ab1.21±0.03c膽固醇含量/（mg/d）4.29±0.302.23±0.19*a3.31±0.21ab4.17±0.17b6.28±0.20c中性固醇總量/（mg/d）5.09±0.162.88±0.09*a4.08±0.13b5.14±0.11bc7.52±0.18c

花椒精對卵巢切除大鼠糞便中中性固醇含量及組成的影響見表4。與Sham組相比，卵巢切除顯著降低了大鼠糞便中糞醇、膽固醇含量和中性固醇總量（P＜0.05）。在OVX各組中，與空白組相比不同劑量的花椒精均可不同程度地升高大鼠糞便中糞醇、膽固醇含量和中性固醇總量；其中花椒精高劑量組大鼠糞便中糞醇、膽固醇含量和中性固醇總量均顯著增加（P＜0.05），增加量分別達到了80.60%、181.61%和161.11%；花椒精中劑量組大鼠糞便中膽固醇和中性固醇含量顯著上升（P＜0.05），分別增加了86.99%和78.47%，糞醇含量增加了32.84%，但未達到顯著水平；花椒精低劑量組大鼠糞便中除中性固醇總量顯著增加了41.70%（P＜0.05）外，糞醇和膽固醇含量分別增加7.46%和48.43%，未達到顯著水平。

3　結(jié)論與討論

在實驗期間，除1只大鼠因手術(shù)感染死亡外，其余大鼠生長狀況良好。本研究表明，切除卵巢后大鼠血液中TC、TG及LDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），同時，卵巢切除可導致大鼠肝臟中TC和TG積聚增加，肝臟外觀呈現(xiàn)脂肪肝形態(tài)，肝臟組織切片中有明顯而豐富的脂肪滴，這與文獻報道一致［17-19］。灌胃花椒精后，可降低卵巢切除大鼠血液中TC、TG和LDL-C濃度，升高HLD-C濃度；并能降低卵巢切除大鼠肝臟中TC、TG含量，防止脂滴積聚，且呈現(xiàn)劑量效應。

膽固醇的代謝吸收是調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)平衡的一個重要因素，其中膽汁酸和中性固醇的排泄量又是衡量膽固醇吸收代謝的一個重要指標。本研究結(jié)果顯示，灌胃花椒精后，卵巢切除大鼠小腸內(nèi)容物和糞便中膽汁酸含量增加，并能促進糞便中糞醇、膽固醇等中性固醇的排泄，表明灌胃花椒精對因雌性激素缺乏誘導的高脂血癥的改善作用可能與促進膽汁酸和中性固醇的排泄有關(guān)。

花椒精中富含花椒麻素和花椒揮發(fā)油。研究顯示，花椒揮發(fā)油可降低高脂膳食豚鼠LDL-C與HLD-C比值，防止動脈粥樣硬化形成［20］?；ń仿樗乜杉せ頣RPV1受體［21-22］，而該受體與體內(nèi)脂質(zhì)代謝密切相關(guān)［23-25］。因此，灌胃花椒精后對卵巢切除大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝的改善作用是否與花椒精中富含的花椒揮發(fā)油和花椒麻素有關(guān)，有待進一步研究。

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Effect of Oleoresin from Zanthoxylum bungeanum on Lipid Metabolism in Ovariectomized Rats

YOU Yuming1，2，REN Wenjin1，LIU Qingqing1，LIU Xiong1，*
（1.Coll ege of Food Science，Southwest University，Chongqing400715，China；2.College of Forestry and Life Science，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing402160，China）

Zanthoxylum bungeanum oleoresin；ovariectomized rats；serum lipid；bile acids；neutral steroid

TS201.4

A

1002-6630（2015）05-0153-05

10.7506/spkx1002-6630-201505029

2014-05-04

國家自然科學基金面上項目（NSFC31171679）；重慶市科學技術(shù)基金項目（CSTC2010BB1350）

游玉明（1983—），男，講師，博士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：xuxiaojiaoyou@126.com

劉雄（1970—），男，教授，博士，研究方向為碳水化合物功能與利用、食品化學與營養(yǎng)學。

E-mail：liuxiong848@hotmail.com