馬蘭中酚類的分離純化及其抑制蛋白糖基化的研究

朱曉琳，劉躍鈞，陸　敏，呂麗爽,*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097；2.浙江省麗水市林業(yè)科學研究所，浙江麗水323000）

馬蘭中酚類的分離純化及其抑制蛋白糖基化的研究

朱曉琳1，劉躍鈞2，陸敏1，呂麗爽1,*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇南京210097；2.浙江省麗水市林業(yè)科學研究所，浙江麗水323000）

采用大孔吸附樹脂對馬蘭粗提物進行分離，得到4組含有多酚的洗脫組分（F1、F2、F3、F4）。用Sephadex LH-20色譜柱對F2進一步純化，得到3,5-二咖啡酰奎寧酸和3,4,5-三咖啡?？鼘幩帷Ｍㄟ^建立牛血清白蛋白-甲基乙二醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）和牛血清白蛋白-乙二醛（bovine serum albuminglyoxal，BSA-GO）的蛋白質(zhì)糖基化反應模型，分析各所得組分抑制蛋白質(zhì)糖基化的能力。結(jié)果表明：多酚含量依次為F2＞F1＞F3＞F4，馬蘭各組分對兩種模型引起的蛋白質(zhì)糖基化均具有良好的抑制效果。在BSA-GO的反應模型中，抑制蛋白質(zhì)糖基化效果為3,5-二咖啡酰奎寧酸＞F2＞F3＞F1＞馬蘭粗提取物＞F4，BSA-MGO的反應模型中，抑制蛋白質(zhì)糖基化效果為3,5-二咖啡?？鼘幩幔綟2＞馬蘭粗提取物＞F1＞F4＞F3，此結(jié)果與F2組分中分離得到的3,5-二咖啡?？鼘幩峋哂辛己玫囊种菩Ч恢隆＝Y(jié)論：馬蘭中分離得到的多酚類物質(zhì)——3,5-二咖啡?？鼘幩峋哂泻軓姷囊种芃GO/GO引發(fā)的蛋白糖基化功能。

馬蘭；多酚；3,5-二咖啡?？鼘幩?；蛋白質(zhì)非酶糖基化

馬蘭（Kalimeris）屬菊科，為多年生草本植物，我國南方各省均有分布，在江浙一帶作為蔬菜食用，含多種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸，營養(yǎng)豐富[1]?！侗静菔斑z》中記載其具有清熱利濕、解毒消腫、涼血止血功效?，F(xiàn)代藥理實驗研究證明其具有抗菌[2]、抗炎[3]、提高子宮活力及促血凝[4]、治療肝炎[5]、降血脂[6]作用，是集食用和藥用價值于一身、備受青睞的時令野菜。目前發(fā)現(xiàn)馬蘭中含有黃酮類[7]、三萜類[8]、甾體類化合物[9]。季鵬等[10]首次從馬蘭全草80%乙醇提取物中分離并鑒定了5 個酚類化合物：漢黃芩素、千層紙素A、4-羥基苯乙酮、7,4-二羥基異黃酮、芹菜素。

蛋白質(zhì)非酶糖基化又稱美拉德反應，是由還原糖與氨基酸和蛋白質(zhì)的游離氨基通過非酶促反應形成的結(jié)構(gòu)多樣的聚合物。1984年Brownlee等[11]將體內(nèi)類似于美拉德反應途徑形成的一類穩(wěn)定的聚合物定義為晚期糖基化終產(chǎn)物（advance glycation end products，AGEs）?，F(xiàn)代研究表明蛋白質(zhì)非酶糖基化與糖尿病并發(fā)癥[12]、白內(nèi)障[13]、阿茨海默病[14]等慢性病密切相關(guān)。

活性二羰基化合物乙二醛（glyoxal，GO）和甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）為蛋白質(zhì)非酶糖基化中間體，極易與游離氨基酸和蛋白質(zhì)的游離氨基發(fā)生反應，生成晚期糖基化終產(chǎn)物[15]。在糖基化反應中，MGO和GO的活性是葡萄糖的20 000倍[16]。研究發(fā)現(xiàn)MGO可以引起體內(nèi)多種蛋白發(fā)生非酶糖基化反應，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）[17]、膠原蛋白[18]等。另外，糖尿病患者血漿中GO和MGO的含量較高，MGO含量為16～27 μg/100 mL，而正常人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)量為3.0～7.0 μg/100 mL[19]。目前在多種食品中也發(fā)現(xiàn)MGO和GO的存在，如蜂蜜、面包、葡萄酒、啤酒和沙丁魚油[20-24]。因此對于抑制MGO與GO引起的蛋白質(zhì)非酶糖基化的研究具有重大意義。

眾多學者對各種抑制或改變糖基化進程的物質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)了一系列天然或者合成的化合物可抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化，如大蒜提取物[25]、黃酮類化合物[26]、氨基胍[27]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[28]，馬蘭粗提物具有良好的抑制蛋白糖基化的效果，抑制率達到49%～71%，其抑制作用與馬蘭中的多酚含量存在一定的線性關(guān)系。本實驗旨在對馬蘭多酚提取物進行分離純化，鑒定其主要組成，并分析馬蘭粗提物中抑制蛋白糖基化主要組分，為馬蘭抑制蛋白糖基化從而減少糖尿病并發(fā)癥發(fā)生提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

優(yōu)質(zhì)馬蘭（取可食部分，即葉子及地下嫩莖）浙江省麗水市林業(yè)科學研究院馬蘭種質(zhì)資源圃。

AB-8型大孔吸附樹脂南開大學化工廠；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠樹脂美國GE Healthcare公司；3,5-咖啡酰奎寧酸標準品成都普瑞法生物制劑公司；牛血清白蛋白、青霉素鏈霉素混合液生工生物工程（上海）股份有限公司；MGO、GO美國Sigma公司；其他均為分析純，購自南京化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

AUY220分析天平日本島津公司；722型可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；KQ-300B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城儀器廠；LD5-10低速離心機北京醫(yī)用離心機廠；XW-80A微型旋渦混合儀、DBS-100電腦全自動部分收集器、DHL-A恒流泵、HD-3型紫外檢測儀上海滬西分析儀器有限公司；GF254薄層層析硅膠板煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；WFH-201B紫外投射反射儀上海精科實業(yè)有限公司；1290型高效液相色譜儀、9460型四極桿串聯(lián)質(zhì)譜美國安捷倫公司；AVANCE400型核磁共振波譜儀瑞士Bruker公司；GL-22M超高速離心機賽特湘儀離心機儀器有限公司；Infinite 200Pro TECAN奧地利Tecan有限公司；150E光照培養(yǎng)箱金壇市吉特實驗儀器廠。

1.3方法

1.3.1馬蘭總多酚粗提物的制備

馬蘭→干燥→粉碎→80%乙醇溶液提?。弦罕?∶10（m/V）），60 ℃水浴60 min→磁力攪拌→離心（1 800×g，20 min）→殘渣以同樣的方法重復提取2 次→減壓濃縮→冷凍干燥→4 ℃冷藏備分析用

1.3.2大孔吸附樹脂對馬蘭粗提物的分離

將AB-8樹脂裝柱（Ф6 cm×60 cm），將馬蘭粗提物用超聲處理溶解進行濕法上樣，先用水洗脫至洗脫液無色，再依次用20%、40%、60%、80%不同體積分數(shù)的乙醇洗脫，各洗脫5 個柱體積，洗脫速率為1 BV/h收集各組分流出液，用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC），展開體系為：V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（甲醇）∶V（水）=5∶3∶1∶1，檢測洗脫液，將Rf值相同的洗脫組分合并，減壓濃縮，冷凍干燥。分別得到F1（20%洗脫組分）、F2（40%洗脫組分）、F3（60%洗脫組分）、F4（80%洗脫組分）。

1.3.3Sephadex LH-20色譜柱純化F2組分

將洗脫組分用少量80%乙醇溶解，14 000×g離心5 min，取上清液過Sephadex LH-20柱，用80%乙醇等梯度洗脫。恒流泵控制流速為1 mL/min，部分收集器收集洗脫液，5 mL/管，用TLC跟蹤分析每管洗脫液，將Rf值相同的洗脫組分合并。得到新的洗脫物。將新洗脫物用40%～50%的乙醇過Sephadex LH-20柱，相同條件下過兩次，得到化合物Ⅰ。

經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，各組分經(jīng)真空冷凍干燥至恒質(zhì)量。分別精密稱取一定質(zhì)量的樣品溶于80%乙醇中，采用Folin-Ciocalteus法測定，以沒食子酸為對照品[29]，測定總多酚含量，并按式（1）計算，并按公式（2）計算其得率。

式中：m1為樣品中總多酚質(zhì)量/mg；m2為樣品質(zhì)量/mg。

式中：m1為樣品中總多酚的質(zhì)量/mg；m3為純化前樣品中總多酚的質(zhì)量/mg。

1.3.4高效液相色譜-質(zhì)譜（high perfor mance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱，DAD檢測器。流速：0.5 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：280 nm。流動相A：乙腈，流動相B：體積分數(shù)0.05%甲酸水溶液。流動相梯度：0 min（20% A），0～20 min（20%～30% A），20～40 min（30%～60% A）；進樣量：3 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（ESI）源，負離子模式檢測，噴霧電壓為10 kV，毛細管溫度為300 ℃，氮氣流速為1 L/min。

1.3.5馬蘭各活性組分抑制蛋白質(zhì)糖基化活性[28]

采用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液配制質(zhì)量濃度為30 mg/mL BSA和濃度為20 mmol/L的GO/MGO，分別加入不同馬蘭組分F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡?？鼘幩峒榜R蘭粗提物，質(zhì)量濃度均為30 mg/mL。青霉素鏈霉素混合液體積分數(shù)為0.5%。將所有試劑和材料加入反應管后，密封管口，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應168 h。期間每24 h取樣500 μL，立即放入─80 ℃冰箱冷凍結(jié)束反應.，作為陽性對照組。以0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液代替不同馬蘭組分做如上操作，作為陰性對照。稀釋10 倍后利用酶標儀在Ex/Em340nm/465nm測定熒光值。讀465 nm熒光強度得出樣品管吸光度（A）值。應用以下公式計算化含物對BSA糖基化反應的抑制作用，用抑制率表示。

2　結(jié)果與分析

2.1分離所得組分結(jié)果

表1　乙醇洗脫組分總多酚質(zhì)量分數(shù)Table1Total polyphenol contents of elution fractions by aqueous ethanol

由表1可知，F(xiàn)2組分總多酚得率最高，達到48.97%，多酚組成種類相對較為單一。雖然F1總多酚含量略高于F2，故對F1進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)其組成復雜，種類多，單一含量低，難以得到主要成分。本研究對F2做進一步分析。

2.2F2純化產(chǎn)物分析

F2經(jīng)過Sephadex LH-20色譜柱的進一步純化，得到Fr2。

2.2.1成分Ⅰ的結(jié)構(gòu)分析

Fr2的高效液相色譜圖如圖1A所示，圖中顯示有兩個主要峰，分別對應成分Ⅰ和成分Ⅱ。經(jīng)Sephadex LH-20柱反復分離，得到成分Ⅰ，純度為96%。對成分Ⅰ進行了HPLC-MS和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析。

成分Ⅰ的一、二級質(zhì)譜圖如圖1B和圖1C，出現(xiàn)m/z 515[M-H]-的準分子離子峰，表明該化合物的相對分子質(zhì)量為516；另有m/z 353[M-H-162]-的碎片離子峰。在ESI-MS2圖中，出現(xiàn)m/z 191[M-H-162-162]-的碎片離子峰。推測該化合物中存在高度對稱結(jié)構(gòu)，分子式為C25H24O12，結(jié)合文獻[30-31]和該物質(zhì)的紫外吸收光譜（圖1D），初步推測成分Ⅰ是二咖啡酰奎寧酸。

圖1　Fr2的高效液相色譜圖（A）及成分Ⅰ的一級（B）、二級（C）C質(zhì)譜和紫外吸收光譜圖（D）DFig.1HPLC of Fr2（A）and ESI-MS（B），ESI-MS2（C），ultra-violent spectrum（D）of compoundⅠ

成分ⅠESI-MS m/z 515[M-H]-（分子式為C25H24O12）。1H-NMR（400 MHz，MeOD）：δ 2.26（2H，m），5.40（1H，m），4.00（1H，d，J=4.4Hz），5.45（1H，m），2.35（1H，brd），2.30（1H，m），7.08（2H，brs，H-2'和H-2''），6.80（2H，d，J=8.4 Hz，H-5'和H-5”），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz，H-6'和H-2''），7.65（1H，d，J=16.0 Hz），6.39（1H，d，J=16.0 Hz），7.08（2H，brs，H-2'和H-2''），6.80（2H，d，J=8.4 Hz，H-5'和H-5''），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz，H-6'和H-2''），7.57（1H，d，J=16.0 Hz），6.30（1H，d，J=16.0 Hz）。

13C-NMR（150 MHz，MeOD）：δ 73.3（C-1），36.2（C-2），70.7（C-3），69.2（C-4），71.7（C-5），34.6（C-6a），175.9（C-7），126.5（C-1'），113.9（C-2'），145.6（C-3′），148.2（C-4'），115.1（C-5'），121.6（C-6'），145.9（C-7'），114.2（C-8'），167.5（C-9'），126.4（C-1''），113.7（C-2''），145.6（C-3''），148.1（C-4”），115.1（C-5''），121.6（C-6''），145.4（C-7''），113.7（C-8''），166.9（C-9''）。

具體的1H-NMR和13C-NMR信息如下：

1H-NMR給出了兩組咖啡?；|(zhì)子的特征信號δ 7.08（2H，brs），6.98（2H，brd，J=8.4 Hz），6.80（2H，d，J=8.4 Hz）和兩組AB型的反式烯質(zhì)子信號δ 7.65（1H，d，J=16.0 Hz），7.57（1H，d，J= 16.0 Hz），6.39（1H，d，J=16.0 Hz），6.30（1H，d，J=16.0 Hz）。同時顯示了奎尼酸基團的存在，包括4 個亞甲基質(zhì)子：δ 2.26（2H，m，H-2），2.35（1H，brd，H-6a），2.30（1H，m，H-6b）。此外也顯示了3 個連氧氫的存在：δ 4.00（1H，d，J=4.4 Hz，H-4），5.40（1H，m，H-3），5.45（1H，m，H-5）。

13C-NMR數(shù)據(jù)顯示了該化合物中存在2 個亞甲基碳（δ 34.6，36.2），3 個連氧次甲基碳（δ 69.2，70.7，71.1）、1個季碳（δ 73.3）和1 個羰基碳信號（δ 175.9）。

化合物Ⅰ的1H-NMR圖中顯示了H-3和H-5存在低場位移，同時13C-NMR圖中也顯示了C-3和C-5存在低場位移，證明了兩個咖啡?；B在奎尼酸的3號位和5號位上，以上NMR數(shù)據(jù)與文獻報道[32-33]3,5-二咖啡?？鼘幩嵋恢拢_認成分Ⅰ為3,5-二咖啡?？鼘幩?。

2.2.2成分Ⅱ的結(jié)構(gòu)分析

成分Ⅱ的液相色譜圖如圖1A，在成分Ⅱ旁邊存在兩個尖峰，說明成分Ⅱ未達到完全分離，存在同分異構(gòu)體。一級質(zhì)譜和紫外吸收光譜圖見圖2A和圖2B。在ESI-MS圖中，出現(xiàn)m/z 677[M-H]-的準分子離子峰，表明該化合物的分子質(zhì)量為678 g/mol；另有m/z 515[MH-162]-和m/z 161的碎片離子峰。據(jù)文獻[34-35]報道，3,4,5-三咖啡酰奎寧酸的一級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)為677[M-H]-的準分子離子峰，二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)中有515[M-H-162]-和m/z 191的碎片離子峰。而該物質(zhì)的紫外吸收光譜與化合物Ⅰ相似，推測該物質(zhì)與化合物Ⅰ相似，為3,4,5-三咖啡?？鼘幩?。

圖2成分Ⅱ的二級質(zhì)譜圖（A）及紫外吸收光譜圖（B）BFig.2ESI-MS（A）and ultra-violent spectrum（B）of compoundⅡ

2.3馬蘭不同分離組分對BSA-GO的抑制

馬蘭不同組分（F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡酰奎寧酸、馬蘭粗提物）抑制GO引起的蛋白質(zhì)糖基化效果如圖3A、3B所示。馬蘭不同組分的抑制效果排序如下：F4＜馬蘭粗提物＜F1＜F3＜F2＜3,5-二咖啡酰奎寧酸。其中，F(xiàn)2 組分的抑制效果明顯高于馬蘭粗提物的抑制作用，說明經(jīng)過大孔吸附樹脂的富集和純化，40%乙醇洗脫的組分中含有較多能夠抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化的活性物質(zhì)；F2組分分離得到的3,5-二咖啡?？鼘幩峋哂蟹浅：玫囊种谱饔茫种坡蔬_到92%；F1與F3的抑制效率相似，略高于馬蘭粗提物的抑制作用，且與馬蘭粗提液的抑制作用存在顯著性差異，說明F1與F3中含有能夠抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化的活性物質(zhì)，但是活性物質(zhì)成分沒有F2組分多；而F4的抑制作用較弱，因此F4組分中含有的活性成分較少。

圖3馬蘭組分對BSA-GO模型中AGEs的抑制作用Fig.3The AGEs inhibitory effect of Kalineris in BSA-GO assay

2.4馬蘭不同分離組分對BSA-MGO的抑制

圖4馬蘭組分對BSA-MGO模型中AGEs的抑制作用Fig.4The AGEs inhibitory effect of Kalineris in BSA-MGO assay

馬蘭不同組分（F1、F2、F3、F4、3,5-二咖啡?？鼘幩幔┮种芃GO引起的蛋白質(zhì)糖基化效果如圖4A、4B所示。馬蘭不同組分的抑制效果排序如下：F3＜F4＜F1＜馬蘭粗提物＜F2＜3,5-二咖啡酰奎寧酸。其中，3,5-二咖啡?？鼘幩峤M分的抑制效果最佳，抑制率達到95%，與2.3節(jié)結(jié)果一致；F2組分的抑制效果較粗提取液好，F(xiàn)1組分的抑制作用略低于粗提液，而F3、F4組分的抑制效果遠低于粗提物，說明經(jīng)過大孔吸附樹脂的富集和純化，功能成分大部分被20%乙醇和40%乙醇洗脫下來，而60%乙醇和80%乙醇洗脫液中的功能成分含量很少。

3　結(jié)論

對馬蘭進行分離純化，選取40%乙醇洗脫物經(jīng)過AB-8型大孔吸附樹脂和Sephadex LH-20多次純化后，得到兩個組分，其中一個經(jīng)質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、NMR等技術(shù)方法鑒定為3,5-二咖啡?？鼘幩?；另一個通過MS推斷為3,4,5-三咖啡酰奎寧酸。

研究大孔吸附樹脂純化所得組分和3,5-二咖啡?？鼘幩嵋种频鞍踪|(zhì)非酶糖基化效果時發(fā)現(xiàn)，40%乙醇洗脫組分F2較粗提物具有更好的抑制效果，抑制率達到70%以上，因此經(jīng)過大孔吸附樹脂的富集和純化，40%乙醇洗脫組分中含有較多抑制蛋白質(zhì)糖基化的成分。3,5-二咖啡?？鼘幩岬囊种菩Ч罴眩_到90%以上。對馬蘭抑制蛋白糖基化進行研究，進一步了解其藥用價值，可為抑制AGEs新藥研發(fā)提供新的思路，開發(fā)出藥食同源、綠色、安全、副作用小的降血糖產(chǎn)品。

[1] 許泳吉. 野生植物馬蘭的營養(yǎng)成分[J]. 山東化工, 2006, 35(2): 42-44.

[2] 蘇月梅. 三種常見藥用植物抗菌作用的探討[J]. 呂梁教育學院學報, 2005, 22(2): 34-36.

[3] 姚曉偉, 陶小琴. 馬蘭提取物抗炎作用的實驗研究[J]. 陜西中醫(yī), 2010, 31(11): 1559-1562.

[4] 唐祖年, 楊月, 楊成芳. 馬蘭對動物離體子宮的興奮作用及促凝血的試驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(9): 2294-2295.

[5] 杜照全. 馬蘭鼠曲湯治療乙肝64例[J]. 河南中醫(yī)藥學刊, 1996, 11(5): 30-31.

[6] 劉新明. 馬蘭活性物質(zhì)降血脂的機理研究[D]. 南京: 南京師范大學, 2012.

[7] 張燦, 張海暉, 武妍, 等. 馬蘭黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性[J].農(nóng)業(yè)工程學報, 2011, 27(增刊2): 307-311.

[8] 龔小見, 周欣, 許文清, 等. 馬蘭中的三萜類成分[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(3): 327-330.

[9] 許文清, 龔小見, 周欣, 等. 馬蘭化學成分研究[J]. 中草藥, 2010, 41(7): 1056-1060.

[10] 季鵬, 王國凱, 劉勁松, 等. 馬蘭中的五個酚性化合物[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(2): 212-214.

[11] BROWNLEE M, VLASSARA H, CERAMI A. Nonenzymatic glycosylation and the pathogenesis of diabetic complications[J].Annals of Internal Medicine,1984, 101(4): 527-537.

[12] SKOLNIK E Y, YANG Z, MAKITA Z, et al. Human and rat mesangial cell receptors for glucose modifi ed proteins: potential role in kidney tissue remodelling and diabetic nephropathy[J]. The Journal of Experimental Medicine, 1991, 174(4): 931-939.

[13] SHAMSI F A, SHARKEY E, CREIGHTON D, et al. Maillard reactions in lens proteins: methylglyoxal-mediated modifi cations in the rat lens[J]. Experimental Eye Research, 2000, 70(3): 369-380.

[14] WOLTJER R L, MAEZAWA I, OU J J, et al. AGE precursor alters intracellular amyloid-APP carboxy-terminal fragment aggregation and cytotoxicity[J]. Journal of Alzheimer Disease, 2003, 5(6): 467-476.

［15］LEDL F，SCHLEICHER E.Die Maillard-Reaktion in lebensmitteln und im menschlichen K?rper-neue ergebnisse zu chemie，biochemie und medizin［J］.Angewandte Chemie，1990，102（6）：597-626.

[16] CHUYEN N V. Toxicity of AGEs generated from the Maillard reaction: on the relationship of food-AGEs and biological-AGEs[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2006, 50(12): 1140-1149.

[17] WESTWOOD M E, MCLELLAN A C, THORNALLEY P J. Receptor-mediated endocytic uptake of methylglyoxal-modifi ed serum albumin[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(51): 32293-32298.

[18] YUEN A, LASCHINGER C, TALIOR I, et al. Methylglyoxal-modifi ed collagen promotes myofibroblast differentiation[J]. Matrix Biology, 2010, 29(6): 537-548.

[19] KHUHAWAR M Y, KANDHRO A J, KHAND F D. Liquid chromatographic determination of glyoxal and methylglyoxal from serum of diabetic patients using mesostilbenediamine as derivatizing agent[J]. Analytical Letters, 2006, 39(10): 2205-2215.

[20] WEIGEL K U, OPITZ T, HENLE T. Studies on the occurrence and formation of 1,2-dicarbonyls in honey[J]. European Food Research and Technology, 2004, 218(2): 147-157.

[21] LIU Huicui, LI Juxiu. Changes in glyoxal and methylglyoxal content in the fried dough twist during frying and storage[J]. European Food Research and Technology, 2013, 238(2): 323-331.

[22] REVEL G D E, BERTRAND A. A method for the detection of carbonyl compounds in wine: glyoxal and methylglyoxal[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1993, 61(2): 267-272.

[23] BARROS A, RODRIGUES J A, ALMEIDA P J, et al. Determination of glyoxal, methylglyoxal and diacetyl in selected beer and wine by HPLC with UV spectrophotometric detection after derivatization with o-phenylendiamine[J]. Liquid Chromatography and Related Technologies, 1999, 22(13): 2061-2069.

[24] ARRIBAS-LORENZO G, MORALES F J. Analysis, distribution, and dietary exposure of glyoxal and methylglyoxal in cookies and their relationship with other heat-induced contaminants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(5): 2966-2972.

[25] AHMAD M S, AHMED N. Antiglycation properties of aged garlic extract: possible role in prevention of diabetic complications[J]. Journal of Nutrition, 2006, 136(3): 796-799.

[26] WU Chihao, YEN G C. Inhibitory effect of naturally occurring flavonoids on the formation of advanced glycation endproducts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(8): 3167-3173.

[27] THORNALLEY P J. Use of aminoguanidine (Pimagedine) to prevent the formation of advanced glycation endproducts[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2003, 419(1): 31-40.

[28]朱曉琳, 劉躍鈞, 陸敏, 等. 不同品種馬蘭的活性組分及抑制蛋白糖基化功能[J]. 食品科學, 2014, 35(9): 90-95.

[29] 李靜, 聶繼云. Folin-酚法測定水果及其制品中總多酚含量的條件[J].果樹學報, 2008, 25(1): 126-131.

[30] GOUVEIA S, CASTILHO P C. Antioxidant potential of Artemisia argentea L’Hér alcoholic extract and its relation with the phenolic composition[J]. Food Research International, 2011, 44(6): 1620-1631.

[31] KAMMERER D, CARLE R, SCHIEBER A. Characterization of phenolic acids in black carrots (Daucus carota ssp. sativus var. atrorubens Alef.) by high-performance liquid chromatography/ electrospray ionization mass spectrometry[J]. Mass Spectrometry, 2004, 18(12): 1331-1340.

[32] GOUVEIA S, CASTILHO P C. Characterisation of phenolic acid de rivatives and flavonoid s from different morphological parts of Helichrysum obconicum by a RP-HPLC-DAD-(-)-ESI-MSnmethod[J]. Food Chemistry, 2011, 129(2): 333-344.

[33] CHOI S U, CHOI S Z, LEE K R, et al. Phytochemical constituents of the aerial parts from aster hispidus[J]. Natural Product Sciences, 2004, 10(6): 335-340.

[34] KIM J Y, CHO J Y, MA Y K. Dicaffeoylquinic acid derivatives and flavonoid glucosides from glasswort (Salicornia herbacea L.) and their antioxidative activity[J]. Food Chemistry, 2011, 125(1): 55-62.

[35] JAISWAL R, PATRAS M A, ERAVUCHIRA P J, et al. Profile and characterization of the chlorogenic acids in green robusta coffee beans by LC-MSn: identifi cation of seven new classes of compounds[J]. Food Chemistry, 2010, 58(15): 8722-8737.

Separation，Purification and Inhibitory Effect on Protein Glycosylation of Phenols in Kalimeris

ZHU Xiaolin1，LIU Yuejun2，LU Min1，L?Lishuang1，*
（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing210097，China；2.Lishui Forestry Research Institute of Zhejiang Province，Lishui323000，China）

Macroporous resin was used to separate the crude extract of Kalimeris and four polyphenol-rich fractions （F1, F2, F3, and F4） were obtained. F2 was further purif ed by Sephadex LH-20 column chromatography and 3,5-dicaf eoylquinic acid and 3,4,5-tricaf eoylquinic acid were obtained. Using the protein glycosylation reaction models of bovine serum albumin-methylglyoxal （BSA-MGO） and bovine serum albumin-glyoxal （BSA-GO）, we analyzed the inhibitory activity of each component on protein glycosylation. The results showed that the content of polyphenols was in the order of F2 > F1 > F3 > F4, and all the four fractions had good inhibitory ef ects on protein glycosylation in both models. In BSA-GO reaction model, the inhibitory capacity against protein glycosylation was in the order of 3,5-dicaf eoylquinic acid > F2 > F3 > F1 > crude extract of Kalimeris > F4. In BSA-MGO reaction model, the inhibitory capacity against protein gly cosylation was in the order of 3,5-dicaf eoylquinic acid > F2 > crude extract of Kalimeris > F1 > F4 > F3. These results are consistent with the inhibitory ef ect of 3,5-dicaf eoylquinic acid separated from F2. The 3,5-dicaf eoylquinic acid as a phenolic compound from Kalimeris had a potent inhibitory ef ect on protein glycosylation induced by MGO or GO.

Kalimeris； polyphenols； 3,5-dicaf eoylquinic acid； protein non-enzymatic glycosylation

TS201.4

A

1002-6630（2015）05-0061-06

10.7506/spkx1002-6630-201505012

2014-05-19

浙江省自然科學基金項目（LY12C15001）；江蘇省基礎研究（自然科學）基金項目（BK2012850）；江蘇省普通高校自然科學研究資助項目（12KJB550005）

朱曉琳（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學。E-mail：marynutralong@gmail.com

呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學、功能性食品的分離及活性。E-mail：lishuanglv@126.com