巴氏桿菌診斷技術研究進展

許澤芳+謝永興+郭樹源+趙翠+常維山

摘要： 本文主要對巴氏桿菌當前比較流行的診斷技術進行了匯總，并且引用了當前國內(nèi)外的一些研究成果并進行了分析。對該菌的分子生物學診斷技術的靈敏度和特異性進行了介紹，對此病原菌的實驗室研究提供了多種方法，最后展望了其分子生物學方法應用于實踐的前景和存在的問題，為進一步開展基礎研究提供了思路。

關鍵詞：巴氏桿菌;診斷技術;應用

中圖分類號：S854.4 ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ?文章編號：1673-1085（2015）03-0038-04

巴氏桿菌病（Pastenrellosis）是由巴氏桿菌屬細菌引起畜禽共患的一種急性傳染病，主要是由多殺性巴氏桿菌引起，發(fā)生于各種家畜、家禽、野生動物和人類的一種傳染病的總稱。本病為世界性分布，近年來，由于飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、藥物的濫用、繼發(fā)感染或動物機體自身的抵抗力低下等原因，巴氏桿菌的感染病例數(shù)量及感染物種不斷擴大，關于野生動物的病例報道也很多[1]?；疾游锛毙圆±詳⊙Y和炎性出血過程為主要特征，慢性經(jīng)過時則表現(xiàn)為皮下組織、關節(jié)、各臟器的局灶性化膿性炎癥。在獸醫(yī)臨床上，以由多殺性巴氏桿菌感染引起的禽霍亂、豬肺疫、牛出血性敗血癥以及由溶血性巴氏桿菌某些亞型引起的羊的溶血性巴氏桿菌敗血癥等最為多見。

根據(jù)Bengey's 細菌學鑒定手冊，引起巴氏桿菌病的病原主要有 4種，即多殺性巴氏桿菌（P.multocida）、溶血性巴氏桿菌（P.heamolytica）、嗜肺巴氏桿菌（P.pneumotropica）和脲巴氏桿菌（P.ureae）等[2，3]。本屬細菌除致病作用和血清型不同外，其形態(tài)和培養(yǎng)特性幾乎完全一致。

應用常規(guī)的診斷方法診斷巴氏桿菌雖然具有許多優(yōu)點， 但由于多殺性巴氏桿菌抵抗力不強，在直射陽光、干燥、無菌蒸餾水和生理鹽水中迅速死亡，且診斷時存在費時、費力、敏感性低、漏診、誤診的缺點，應該尋找新的診斷技術，利用現(xiàn)代科學技術為養(yǎng)殖戶挽回損失。隨著分子生物技術的不斷應用和發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學技術如核酸雜交技術、聚合酶鏈式反應（PCR） 技術、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、核苷酸序列分析和基因芯片等， 將在疾病的準確、快速診斷中扮演重要角色。

1 ?病原學診斷

巴氏桿菌正常存在于多種健康動物的口腔和咽部黏膜，當動物處于應激狀態(tài)，機體抵抗力低下時，細菌容易侵入體內(nèi)，大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性傳染。因此掌握一些基本的診斷技術是相當關鍵的，特別是依靠一些普通的實驗微生物診斷技術尤為關鍵。

1.1 ?巴氏桿菌的分離培養(yǎng) ?分離培養(yǎng)可用患病動物的組織、肝臟等新鮮病料，接種于鮮血瓊脂平板、馬丁氏血清瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血清肉湯培養(yǎng)基等營養(yǎng)物質(zhì)高的培養(yǎng)基上，馬丁氏血清瓊脂平板上菌落微隆起、呈圓形、灰白色露滴狀，中等大小。在血瓊脂平板上長成水滴樣小菌落，溶血性巴氏桿菌出現(xiàn)溶血，但多次傳代后溶血性也會消失，多殺性巴氏桿菌則無溶血環(huán)。在血清肉湯中培養(yǎng)，開始輕度渾濁，4～6h 后液體變清亮，管底部出現(xiàn)粘稠沉淀，震搖后不分散，表面形成菌環(huán)。巴氏桿菌在麥康凱瓊脂上生長緩慢甚至不生長，菌落為紅色。在本屬中，多殺性巴氏桿菌是危害畜、禽最為嚴重的一種，從患病的動物體液或組織中分離培養(yǎng)得到的菌落基本上分為兩種：一種為通過45°折光，在低倍顯微鏡下呈現(xiàn)鮮明的藍綠色而帶金光，邊緣有狹窄的紅黃色帶的Fg菌落型，相當于血清型乙型。對小白鼠、家兔和豬毒力強大，每只注射活菌10～200個即可致死，而對家禽每只必須注射10個以上才可致死;另一種為在45°折光下，菌落呈現(xiàn)橘紅色，邊緣稍帶狹窄的黃綠光的FO菌落型，相當于血清型甲型。對雞、鴿毒力強大，對豬的毒力較次，家兔對兩型的致死量無甚差異。在中國，牛、豬、驢和馬的多殺性巴氏桿菌病絕大多數(shù)為Fg型菌所致，家禽流行性巴氏桿菌病都是FO型菌所致。慢性病例中偶爾發(fā)現(xiàn)菌落較小、折光下呈現(xiàn)淡藍色的菌落。自病兔分離的菌落也都是FO型。

1.2 ?巴氏桿菌的染色與鏡檢 ?將患病動物的組織滲出液、肝、脾、淋巴結、骨髓等新鮮組織涂片或制作成觸片，用瑞氏染色液或堿性美蘭液染色，五分鐘后放在油鏡下鏡檢，能夠發(fā)現(xiàn)典型的兩極濃染的短桿菌，即菌體兩端染色深，中間淺，無鞭毛，不形成芽孢，用印度墨汁等染料染色，可見清晰的莢膜，就可以初步診斷為巴氏桿菌感染。純培養(yǎng)物進行革蘭氏染色、鏡檢，可見紫紅色且兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿狀或短桿狀菌。

1.3 ?巴氏桿菌的生化試驗鑒定 ?多殺性巴氏桿菌在48h內(nèi)可分解葡萄糖、果糖、單奶糖、蔗糖和甘露糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。一般不發(fā)酵乳糖、鼠李糖、菊糖、水楊苷和肌醇，可產(chǎn)生硫化氫，能形成靛基質(zhì)，M.R.和V-P試驗均為陰性。接觸酶和氧化酶試驗均為陽性。溶血性巴氏桿菌不產(chǎn)生靛基質(zhì)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，能發(fā)酵葡萄糖、糖元、肌醇、麥芽糖、淀粉;不發(fā)酵側金盞花醇、菊糖和赤蘚醇。

1.4 ?動物實驗 ?可用病畜的病料乳劑制成1：10懸液，或用已制成的分離培養(yǎng)菌，皮下注射小鼠、家兔或鴿，動物多在24～48h內(nèi)死亡。由于健康動物呼吸道內(nèi)常可帶菌，所以應參照病畜的生前臨床癥狀和剖檢變化、分離培養(yǎng)、生化特性作出最后診斷。

2 ?血清學診斷技術

若要鑒定莢膜抗原和菌體抗原型，則要用抗血清或單克隆抗體進行血清學實驗。檢測動物血清中的抗體，可用試管凝集、間接凝集、瓊脂擴散實驗或 ELISA 等方法。

2.1 ?乳膠凝集試驗 ?在制好的巴氏桿菌乳膠液中滴加稀釋的免疫血清0.2～0.7ml，邊加邊搖，當出現(xiàn)肉眼可見的顆粒后，仍繼續(xù)加血清，直至顆粒消失，成為均勻的乳膠懸液為止。鏡下檢查應無自凝。使用時，應與一定稀釋度的相應抗原出現(xiàn)陽性反應，與生理鹽水出現(xiàn)陰性反應為合格。同時以正常血清代替免疫血清進行乳膠致敏，以作對照。endprint

取潔凈玻璃板一塊，用玻璃鉛筆劃成小格，滴加待檢樣品0.1ml，再滴加高免血清致敏乳膠0.01ml，以牙簽或火柴桿混勻，在3min內(nèi)判定結果。根據(jù)乳膠凝集的情況來判定。

2.2 ?酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） ?ELISA分為間接ELISA（i-ELISA）和競爭ELISA（C-ELISA），可用于血清及乳汁樣本中巴氏桿菌的檢測，該法在國內(nèi)外均有商品化檢測試劑盒，國內(nèi)也有類似研究。

國外已報道用多殺性巴氏桿菌毒素（PMT）作為包被抗原建立檢測PMT抗體的ELISA方法，但PMT純化步驟復雜，其中的一些雜蛋白很難除盡，給推廣應用帶來不便。盧順[4]等利用多殺性巴氏桿菌毒素基因的原核表達產(chǎn)物免疫小鼠制備單抗并利用酶標單抗建立了單抗競爭ELISA法用于檢測PMT抗體。李興玉等[5]通過提取豬巴氏桿菌菌株的莢膜和外膜蛋白抗原，首次建立了檢測豬巴氏桿菌病血清抗體的Dot-PPA-ELISA方法，確定了抗原的最佳包被濃度為7.76ul，酶標SPA的最佳稀釋倍數(shù)為1：10。錢建飛等[6]應用抗雞IgM單克隆抗體建立了檢測雞抗多殺性巴氏桿菌血清中特異性IgM抗體的抗體捕獲ELISA（Mac-ELISA），本法具有很高的特異性和良好的重復性。

3 ?DNA指紋技術

目前已有不少利用DNA指紋對多殺性巴氏桿菌分離株進行分類的研究報導[7]。有人曾利用隨機引物PCR （AP-PCR）鑒別了豬呼吸道多殺性巴氏桿菌分離株和免疫火雞多殺性巴氏桿菌分離株。該技術是建立于RFLP基礎上的，具有高度的特異性和穩(wěn)定的遺傳性等優(yōu)點。然而這種方法需采用放射標記來提高其檢測的靈感度，因此限制了該技術的應用。該技術可用同位素標記或者熒光素標記方法從而使菌體基因組中富含某種核苷酸，大大提高了對擴增片段檢測的靈敏度。國內(nèi)有人用隨機擴增多態(tài)性DNA-PCR方法檢測實驗小鼠的嗜肺性巴氏桿菌，結果表明，該法簡便、快捷，具有事先不需要知道被檢菌的基因序列、對試驗條件要求不嚴格等優(yōu)點。此外，基因組重復序列PCR （REP-PCR）指紋在鑒別鳥源和豬源多殺性巴氏桿菌分離株時具有比較高的鑒別能力。

4 ?基因芯片技術在巴氏桿菌診斷中的應用

基因芯片技術能在單一檢測中從種、亞種、型和亞型水平上同時鑒定多種病原，為多病原聯(lián)合檢測和病原分型提供了一項新技術?；蛐酒夹g具有敏感性高、特異性強、高通量和平行性的優(yōu)點。它可將待鑒定病原的多個特征性基因片段固定于玻片等載體上制成檢測或鑒定芯片，不僅可利用PCR的敏感性和簡便性，還能在一次試驗中同時分析目標微生物的多個基因，從而克服因PCR高敏感而引起的非特異性[8]。肖國生[9]等利用七個從胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌3種病菌基因組中擴增出的不同特異性靶DNA制作成基因芯片，用來診斷三種細菌的感染。程亞樓[10]通過選擇16-23S rDNA 間區(qū)序列為靶序列，設計了6種特異性探針實現(xiàn)對多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的鑒定。

5 ?其它PCR 技術在巴氏桿菌診斷中的應用

聚合酶鏈反應（PCR）技術因具有簡便、快速、敏感性高和特異性強的優(yōu)點， 現(xiàn)已廣泛應用于微生物檢測、遺傳病診斷等諸多領域。當前PCR技術仍然是檢測巴氏桿菌的主要方法。而PCR檢測擴增用引物大多根據(jù)Pm的16SrRNA和KMT基因設計[11，12]，經(jīng)Pm 16SrRNA和plpE基因的序列分析得知，Pm 16SrRNA與APP、HPS 16SrRNA序列相似性均達93%以上，所以根據(jù)Pm 16SrRNA建立的PCR存在不足之處。APP、HPS不含有plpE基因且不同血清型Pm plpE基因序列相似性在92%以上。黃海燕[13]等根據(jù)plpE基因是多殺性巴氏桿菌的特異保守基因這一特性，從而建立了以plpE基因為基礎的多殺性巴氏桿菌特異性PCR方法，并用該方法對來自四川的6個規(guī)?；B(yǎng)豬場的64份疑似多殺性巴氏桿菌感染的樣品進行初步檢測，64份疑似樣品中的36份診斷為多殺性巴氏桿菌陽性，檢測結果與經(jīng)傳統(tǒng)細菌分離鑒定的結果基本一致，進一步說明以多殺性巴氏桿菌的plpE基因建立的PCR方法的可靠性和實用性。

2001年，Townsend等利用基因消減的方法對多殺性巴氏桿菌進行研究，發(fā)現(xiàn)了多殺性巴氏桿菌基因組上1個特有區(qū)域，針對該多殺性巴氏桿菌特異性DNA序列設計引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴 增 出1個460bp的 片 段，即Pm-PCR[14]。Hricinova等建立了Pm、HPS和APP的多重PCR，檢測結果與細菌分離鑒定結果相符合[15]。2004年，Kamp等經(jīng)GenBank在線序列比對發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌的翻譯調(diào)節(jié)基因（Pm0762-Pm1231）不存在于其它任何細菌，由此建立的多殺性巴氏桿菌PCR檢測方法具有種屬特異性。Kamp等根據(jù)T+PM的毒素基因建立檢測T+PM的PCR，并證明其與ELISA結果相同[16]。

PCR技術以其特異性、敏感性、快速、簡便和對標本的純度要求低的優(yōu)點， 現(xiàn)已廣泛應用于微生物檢測， 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板，可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測，尤其對培養(yǎng)困難的細菌檢測和抗原結構復雜的細菌鑒定，具有常規(guī)方法無法比擬的優(yōu)越性。

6 ?展望

巴氏桿菌的分子生物學診斷方法具有診斷確實、靈敏度高、特異性強和診斷迅速等一系列優(yōu)點，因此在日常生產(chǎn)實踐中具有廣闊的應用前景。目前巴氏桿菌的分子生物學方法在科研工作中已經(jīng)得到一定的應用。隨著人們對巴氏桿菌認識的不斷深入，為預防和治療此病提供了一定的實驗依據(jù)。但是分子生物學方法對于確診也存在一定的誤差率，單獨使用一種方法的診斷效率往往不高，目前對于巴氏桿菌的實驗室診斷和研究多是幾種實驗方法聯(lián)合起來應用，而不是單用其中的一種方法，例如常規(guī)方法與PCR 法連用、常規(guī)法與克隆表達的連用、ELISA- PCR法、PCR- DNA探針法等，這些方法的聯(lián)合使用使準確率得到提高。但是分子生物學方法的應用具有價格昂貴的缺點，在實際診斷中仍以眼觀和剖檢為主，誤差率較大。應大力研究分子生物學方法，降低生產(chǎn)成本，使其在不久的將來成為一種成熟的診斷技術。endprint

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