磁響應性三元復合材料制備及引導骨缺損修復的研究

校 搏 郝綏綏 吳鳳新 孟 潔 張 宇 劉 健 黃宇光顧 寧#* 許海燕#*

1 (中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730)2 (中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院，北京 100005)3 (東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院生物電子學國家重點實驗室，南京 210096)

磁響應性三元復合材料制備及引導骨缺損修復的研究

校 搏1郝綏綏2吳鳳新2孟 潔2張 宇3劉 健2黃宇光1顧 寧3#*許海燕2#*

1(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730)2(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院，北京 100005)3(東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院生物電子學國家重點實驗室，南京 210096)

創(chuàng)傷、感染、腫瘤和先天畸形等均會造成骨組織的缺損，當缺損超過臨界尺寸時，骨組織無法完成自我修復，應用生物材料引導骨組織的再生從而修復缺損組織是極為重要的治療策略，而骨形成速度慢則是當前引導骨再生支架面臨的難點之一。氧化鐵磁性納米顆粒(γ-Fe2O3-NP)和納米羥基磷灰石(nHA)與消旋聚乳酸(PDLLA)以不同比例共混，利用高壓靜電紡絲技術制備具有納米纖維網絡結構的復合材料薄膜。應用振蕩樣品磁強計研究復合材料的磁學性質與氧化鐵磁性納米顆粒含量之間的關系，通過掃描電鏡觀察薄膜材料的微觀結構特征。選取12只健康雄性成年新西蘭大白兔，在橫突骨組織離斷模型上，采用CT成像技術，研究術后10、30、50 d時復合材料植入組、復合材料植入加磁場組以及離斷無治療對照組的骨組織再生與缺損修復效果；此外，在術后20 d采集每組中2只動物的植入部位組織進行病理觀察。研究結果顯示，復合材料具有超順磁響應性質，且隨材料中氧化鐵納米顆粒比例的提高而增強；該復合材料可以在外加磁場的作用下，加速引導離斷缺損部位的骨組織再生。

骨修復；氧化鐵磁性納米顆粒；復合材料；納米纖維支架

引言

創(chuàng)傷、骨疾病、腫瘤切除等，經常會造成大塊骨缺損且很難自我修復。隨著社會快速發(fā)展與日益增加的人口老齡化，骨修復已成為臨床醫(yī)學和社會經濟的迫切需求，目前，骨科治療中通常使用自體骨或異體骨移植來治療大塊骨缺損，但是這些方法受到很多方面的限制，如來源有限、移植感染、免疫排斥反應等[1-2]。過去數(shù)十年中，研究人員探索和開發(fā)了多種人工生物材料支架作為自體或同種異體骨移植的替代品，并取得了重要進展，這些支架不僅具有良好的生物相容性和接近天然骨組織的微觀結構，而且可以攜帶和緩釋骨形成蛋白等促進骨形成的生物分子[3-6]。盡管如此，支架在體內誘導成骨速度較慢而導致大塊缺損難以修復仍然是其面臨的巨大挑戰(zhàn)。

在正常生理條件下，骨組織感受由重力產生的負荷和由機體運動及體內生理流體產生的剪切、擠壓與牽拉，通過將力刺激轉化為生物化學信號而促進成骨細胞的功能和誘導骨的形成，以維持正常骨量和骨組織的最佳性能。例如，骨小梁受到的流體剪切應力為0.8～3.0 N/m2，組織的應變?yōu)?.03%～0.1%[7]。分析認為，在骨缺損環(huán)境中，支架引導新骨形成速度緩慢的重要原因之一是植入初期支架與正常骨組織間還沒有形成緊密連接，因而無論是來自生理環(huán)境的力刺激還是體外施加的機械力，都難以有效傳遞到植入的支架上，所以支架中的成骨細胞在其增殖和向成骨分化的過程中缺少持續(xù)和適度的力刺激。因此，使支架在骨缺損部位給細胞以力學刺激是加速支架誘導成骨的一個關鍵因素。

一些研究結果表明，外加磁場能加速骨折的愈合[8]，如中等強度的靜磁場能促進兔子的骨及軟骨的愈合[9]；而對MC3T3-E1細胞施加磁刺激，可增加細胞液中游離鈣離子濃度，并將刺激信號傳至細胞核內，促進成骨細胞合成、分泌BMP等生長因子[10]；此外，有報道說，將磁化的金屬材料植入到大鼠股骨中，可以預防骨密度下降[11]。近年來，國內外均有研究組制備含磁性納米顆粒的復合材料支架，探究磁性顆粒對成骨細胞的作用及其在骨缺損修復方面的應用。例如，含有超順磁納米顆粒(MNP)的陶瓷復合物對人成骨細胞Ros17/2.8和MG63表現(xiàn)出良好的相容性，其中超順磁納米顆粒不影響骨形成蛋白(BMP)與復合物的結合，磁性Fe3O4納米顆粒與殼聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)的復合納米纖維膜也表現(xiàn)出促進人成骨細胞(MG63)增殖的功能，含磁性氧化鐵顆粒的多孔生物活性玻璃支架(Fe-MBG)可提高人骨髓間充質干細胞(BMSC)的線粒體活性和骨相關基因(ALP和OCN)的表達[12-14]。本課題組曾經報道，采用溶液混合方法，可制備含有氧化鐵磁性納米顆粒的納米纖維支架材料；在骨的部分缺損模型上，該支架可以響應外加磁場的作用而對生長在支架上的細胞產生力學刺激功能，從而加速新骨的形成[15-16]。

本研究在上述工作的基礎上，采用熱熔共擠出技術制備三元復合材料，研究了復合材料的磁學性質與氧化鐵納米顆粒含量的關系，并在兔橫突骨組織離斷模型上，研究了在外加磁場條件下磁響應性納米纖維復合材料引導骨缺損的修復作用。結果顯示，復合材料的超順磁響應性質隨材料中氧化鐵納米顆粒比例的提高而增強，該復合材料可以在外加磁場作用下加速引導離斷部位骨組織的再生和修復。

1 材料與方法

1.1原料、試劑、手術器械和實驗動物

消旋聚乳酸(Poly (DL-lactide))，簡稱PDLLA購自四川成都迪康公司，平均分子量為80 KD。羥基磷灰石納米粒子(hydroxyapate nanoparticles, nHA)購自南京埃普瑞納米材料有限公司，純度為97%，粒徑為20 nm，低菌低重金屬03型。氧化鐵磁性納米顆粒(γ-Fe2O3-NP)由東南大學顧寧教授實驗室合成，粒徑約為14 nm。二甲基乙酰胺(DMAc)、無水乙醇均為北京化工廠生產分析純試劑。雙抗(青霉素、硫酸鏈霉素)：1×D-Hank’s配制濃度為20萬U/mL的溶液，過濾除菌后分裝至EP管中，封口膜封口，-20 ℃保存。4%多聚甲醛4 ℃保存。

手術用器械主要包括骨科手術常規(guī)器械、骨刀、骨膜剝離子、咬骨鉗等。健康雄性成年新西蘭大白兔12只，體重2.5～3.0 kg，購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2方法

1.2.1復合材料的制備

稱量PDLLA、nHA、γ-Fe2O3-NP等3種材料，按照不同比例混合均勻，通過加樣漏斗加入到熱熔擠出機中(Haake MiniLab Ⅱ (Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Germany)，在120 ℃下共混擠出，得到三元復合材料。將復合材料溶于DMAc中，制成20%(W/V)PDLLA/DMAc溶液，灌注于5 mL的注射器中，針頭與高壓靜電發(fā)生器輸出端連接，針頭與接收屏(鋁箔)的距離20 cm，施加電壓20 kV，緩慢轉動鋁箔接收針頭噴射出的絲束，得到電紡絲薄膜材料，放入真空干燥箱中，常溫下干燥48 h，徹底除去薄膜上殘留的有機溶劑，之后在純凈水中揭下薄膜。部分薄膜用于理化性質表征和磁學性質測定；其余材料折疊成質量相同的塊狀材料，用于動物骨缺損植入實驗。

1.2.2復合材料表征和磁學性質測定

采用掃描電鏡(FEI nova nanosem 450)觀察電紡絲薄膜的微觀結構。用振動樣品磁強計(Vibrating sample magnetometer，VSM)測量電紡絲薄膜的磁化曲線和磁滯回線，從中得出樣品的飽和磁化強度MS。

1.2.3動物骨缺損模型及材料植入實驗

動物稱重，耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥納/生理鹽水溶液(3 mg/kg)麻醉，術中可視情況經耳緣靜脈追加麻醉。待結膜反射消失后，以棉線將四肢固定于動物手術臺上，剪除髂骨手術區(qū)域及周圍的被毛，以碘伏消毒。背部和雙側髂骨常規(guī)消毒，鋪巾。

沿背部正中做5 cm縱切口，以手術節(jié)段L5～L6為中心。切開皮膚、皮下，逐層解剖到椎旁筋膜。止血。切開椎旁筋膜暴露L5、L6棘突，沿棘突中間右側向下鈍性分離肌肉，深度約為1. 5 cm處可見L5橫突。用咬骨鉗咬斷橫突距其根部約1 cm處的骨組織，造成橫突骨組織完全離斷，將復合材料填充至離斷部位。設離斷無治療組為對照(n=4)。對分離的筋膜進行縫合，椎旁筋膜用1-0的Vicryl可吸收線縫合，皮下組織用兩層2-0 Vicryl可吸收線縫合。3-0尼龍線褥式縫合皮膚，傷口以碘伏消毒。術后對所有實驗動物肌注雙抗20萬U/次，1次/d，共3 d。術后將實驗動物按隨機法分為3組，放養(yǎng)于兔籠，自由活動：材料植入組(在常規(guī)籠中飼養(yǎng)，n=4)，材料植入加磁場組(置于兩側固定了磁條的籠中飼養(yǎng)，n=4)，磁場強度為2.5～30 mT。

1.2.4病理觀察分析和CT造影

在材料植入術后10、30、50 d，對各組動物進行CT掃描成像(Somatom Sensation 64, Siemens Medical Solutions, Forchheim, Germany)。其中，在材料植入術后20 d時，各組處死動物2只，取植入材料部位及周圍骨組織，包石蠟塊，切片，進行常規(guī)HE染色，觀察新骨形成和材料被吸收的情況。

1.2.5評價骨組織形成的速度

對骨缺損材料植入術后20 d的病理結果進行骨基質所占比例的分析，通過計算單位材料面積下骨基質和血管所占比例，評價磁場環(huán)境對于順磁性納米纖維復合材料促進骨組織形成的影響。對骨基質或血管占組織總面積比例的計算遵循以下原則：

1)均在20倍物鏡下觀察；

2)當材料面積較大時，選取多個視野作為興趣區(qū)域，以代表總體組織；

3)當植入材料在組織切片上分散為多塊時，默認體積相當?shù)拿恳粔K為獨立組織，其中央的區(qū)域具有代表性，并作為興趣區(qū)域進行計算；

4)計算組織的總面積時，邊緣以材料為界，不包括周圍包裹的成纖維細胞；

5)當看到材料周圍存在血管結構時，將此血管結構的面積計算在內。

1.2.6統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)資料以平均值±標準差表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，P<0.05時認為有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結果

2.1復合材料的微觀結構

電紡絲薄膜的宏觀面積可達700 cm2以上，材質柔軟，有一定韌性(見圖1(a))，可以剪裁、卷繞或折疊成需要的形狀(見圖1(b))。薄膜具有納米纖維網絡特征的微觀結構(見圖1(c))，纖維的直徑在100～300 nm范圍，纖維相互無規(guī)纏結，形成直徑數(shù)十微米的孔隙。納米纖維和微米尺度貫通孔隙構成了三維網絡結構。

圖1 電紡絲薄膜材料的宏觀特征和微觀結構。(a) 電紡絲材料的宏觀形貌照片；(b)電紡絲薄膜材料可以纏繞和折疊；(c)電紡絲薄膜材料的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Morphological characterizations of nanofibrous film. (a) The photograph of nanofibrous film; (b) Twisting and folding of nanofibrous film; (c) The representative SEM image of nanofibrous film.

2.2復合材料的磁學性質

電紡絲薄膜材料的磁化曲線如圖2所示。由圖可見，當施加外加磁場時，復合材料的磁感應強度迅速增加并達到飽和，當外加磁場撤去，復合材料隨即退磁，幾乎沒有出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象，磁化曲線為對稱的S型，表明該復合材料具有超順磁性。此外，隨著復合材料中氧化鐵納米顆粒的質量百分比從1%逐步增加到5%，其磁響應能力隨之增強，表現(xiàn)在磁飽和強度相應增大。

圖2 電紡絲薄膜材料的磁學性質。(a)氧化鐵納米顆粒含量不同的電紡絲薄膜材料的磁化曲線；(b)不同氧化鐵納米顆粒含量不同的電紡絲薄膜材料的飽和磁化強度Fig.2 Magnetic property of nanofibrous film. (a) Magnetization curve of nanofibrous with different proportions of iron oxide nanoparticles; (b) Saturation magnetization of nanofibrous film with different proportions of iron oxide nanoparticles

2.3病理學觀察

對植入順磁性納米纖維復合材料的骨缺損部位的病理組織切片進行觀察，分析材料誘導骨基質形成(見圖3)和血管形成(見圖4)的進程。成骨過程分為成骨細胞增殖期、細胞外基質成熟期及細胞外基質鈣化期。材料植入離斷部位后，會隨著時間而逐漸被降解，由新骨基質所代替，并建立新的血供系統(tǒng)。由圖3可見，術后20 d時，部分成骨細胞(箭頭)的胞質顏色加深；與此同時，材料加磁場組的新骨組織更多(粗箭頭指示的淺粉色區(qū)域)，這意味著成骨細胞的合成分泌骨基質的功能更強。此外，可以看到植入的支架材料更多被吸收，表現(xiàn)為棕色區(qū)域相對較少。從圖4可以看出，在材料加磁場組的植入部位，由內皮細胞形成的血管結構相對較多，同樣棕色的材料區(qū)域相對較少。這些結果說明，在外加磁場的作用下，磁響應性支架可以更快地引導血管結構的形成，有利于在支架內部形成新骨組織。

圖3 材料植入后20 d骨缺損部位組織的HE染色。(a)和(c)無磁場和施加磁場下的組織；(b)和(d)(a)和(c)中黑色方框區(qū)域的放大(細箭頭所指為單核巨噬細胞，粗箭頭所指為新形成的骨基質，三角形所標為成骨細胞)Fig.3 HE staining of pathological on day 20 after implantation. (a) and (c) Newly formed bone tissue without and with magnetic field; (b) and (d) The magnified area of (a) and (c), respectively (Arrow: macrophage cells, bold arrow: newly formed bone matrix, triangle: osteoblast cells)

圖4 材料植入20 d后骨缺損部位組織的HE染色。(a)和(c)無磁場和施加磁場下的組織；(b)和(d)(a)和(c)中黑色方框區(qū)域的放大(細箭頭所指為血管內皮細胞，V所標為血管結構)Fig.4 HE staining of pathological on day 20 after implantation. (a) and (c) Newly formed bone tissue without and with magnetic field; (b) and (d) The magnified area of (a) and (c), respectively (Arrow: endothelial cells, V: vascular structure)

2.4骨基質和血管形成速度的半定量分析

通過對比材料植入后骨基質和血管結構在相同時間點的形成程度，可以評價在外加磁場下磁響應性支架誘導新骨組織形成的作用。

圖5為在施加磁場或無磁場條件下，材料植入20 d后在離斷部位形成的骨基質、血管結構占組織總面積的比例分析結果?？梢?，在施加磁場的條件下，骨基質所占的比例為4.41%，而無磁場環(huán)境下骨基質的比例為1.7%(見圖5(a))，骨離斷部位的植入材料中有更多的骨基質形成，提示外加磁場與磁響應性納米纖維復合材料協(xié)同作用，顯著促進了骨組織的生成；同時，當外加磁場存在時，植入的磁響應性納米纖維復合材料支架中所形成的血管結構比例也表現(xiàn)出增加的趨勢，提示有利于缺損部位血管的形成(見圖5(b))。

圖5 在施加磁場或無磁場條件下，材料植入20 d后在離斷部位形成的骨基質、血管結構占組織總面積的比例(隨機視野數(shù)n=12)。(a)骨基質占組織總面積比例(*P<0.05)；(b)血管結構占組織總面積比例Fig.5 The percentage of newly formed bone matrix and vascular structure in the total area of tissue sample post 20 days of implantation with or without magnetic field. (a) The percentage of bone matrix(*P<0.05); (b) The percentage of vascular structure

2.4骨離斷部位植入復合材料后影像學觀察

由圖6可見，術后10 d，材料組和材料加磁場組的離斷處均可見植入材料，皮質密度較低；術后30 d，材料組和材料加磁場組的橫突骨組織缺損處的密度不均勻性升高，說明開始有新骨形成，但骨皮質仍不連續(xù)；術后50 d，不論在磁場環(huán)境還是無磁場環(huán)境下，植入部位骨離斷處的骨組織密度仍有不均勻性增高，部分皮質密度較低，但骨皮質已經連續(xù)，說明支架已經誘導新骨，將離斷的兩端連接起來；而單純骨缺損組在術后50 d時，骨離斷處的密度仍顯示不均勻性升高，骨皮質明顯不連續(xù)。由此表明，在橫突骨組織完全離斷的情況下，自我修復十分困難；而應用磁響應性納米纖維復合材料作為支架進行修復，則會明顯加快新骨組織的生成和離斷部位的重建與修復。

圖6 橫突離斷條件下術后10、30、50 d CT結果(圖中白色箭頭所指為骨損傷部位)。(a)無植入對照組；(b)施加磁場植入組；(c)無磁場植入組Fig.6 CT images of the bone disarticulation post 10, 30 and 50 days implantation (Bone disarticulation sites pointed by white arrows). (a) Group untreated; (b) Group treated with materials with magnetic field; (c) Group treated with materials without magnetic filed

3 討論和結論

骨是力敏感組織，骨細胞和成骨細胞均為具有骨傳導功能的效應細胞。因此，在骨的再生和修復過程中，給予成骨細胞適當?shù)牧W刺激，對于新骨的形成十分重要。筆者對本實驗結果進行分析后認為，植入體內的磁響應性復合材料與外源性磁場協(xié)同作用，不僅有利于成骨細胞的分化和促進其分泌細胞外基質，而且能夠促進血管的生成，從而促進新骨組織的形成。上述協(xié)同效應近年來也被其他實驗室陸續(xù)報道，如以羥基磷灰石為主體的超順磁性支架在外源性磁場下促進成骨細胞的增殖和分化[17]，多孔磁性羥基磷灰石支架在外加磁場下對細胞的早期增殖具有促進作用[18]，聚乳酸與氧化鐵磁性納米顆粒的復合納米纖維支架在外加磁場下引導成骨細胞沿纖維定向排列生長[19]。

此外，磁響應性支架與外加磁場的協(xié)同作用也促進其他種類細胞的生長，如Sapir等將大孔隙超順磁性海藻酸鹽支架、無磁性海藻酸鹽支架分別與牛主動脈內皮細胞共培養(yǎng)14 d，并在前7 d均施加40 Hz、10～15 G外源性交變磁場，對照組則不施加外源性交變磁場；后7 d撤掉磁場與對照組均進行正常培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，外源性磁場協(xié)同超順磁性海藻酸鹽支架能夠明顯提高內皮細胞的代謝活性，促進其遷移和形成血管樣結構的能力[20]。Liu等發(fā)現(xiàn)，超順磁性甘油磷酸化殼聚糖聚合物支架在外加磁場條件下，有利于施旺氏細胞的黏附和增殖，促進其分泌與神經末梢再生密切相關的細胞因子、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)、神經營養(yǎng)因子3(NT-3)和血管內皮生長因子(VEGF)等[21]。Fuhrer等發(fā)現(xiàn)，超順磁性水凝膠支架聯(lián)合周期性外源性磁場(0.8 T)，能夠有效地誘導人骨髓間充質干細胞(hMSC)向軟骨分化，顯著提高硫酸化糖胺聚糖(AGA)的沉積，從而促進軟骨生成[22]。

綜上所述，筆者提出如下機理假說：支架中磁性氧化鐵納米顆粒在外磁場的作用下，其磁矩由無序趨向于與磁場同向；由于與基體材料復合，磁場驅動的無數(shù)微小磁矩的趨向運動將使支架產生局部微振動和微形變，使黏附在支架上的細胞受到牽拉或者扭曲作用，支架由此將外磁場的作用轉化為機械力并直接作用于細胞。這種協(xié)同效應適用于引導多種組織修復，因此該性質在生物材料支架引導組織再生方面可能具有普適性的促進作用。

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Magnetic Responsive Scaffolds Enhance Bone Repair in the Applied Magnetic Field

Xiao Bo1Hao Suisui2Wu Fengxin2Meng Jie2Zhang Yu3Liu Jian2Huang Yuguang1Gu Ning3#*Xu Haiyan2#*

1(Department of Anesthesia, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China)2(Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)3( School of Biological Science and Medical Engineering, State Key Laboratory of Bioelectroncs, Southeastern University, Nanjing 210096, China)

Bone tissue cannot accomplish self-healing in critical size bone defects resulted from trauma, infection, tumor and congenital malformation. Using biomaterials that induce bone tissue regeneration to repair bone defects is an extremely important therapeutic strategy. However, slow bone formation is one of the difficulties in biomaterial-induced bone regeneration. In this work, a magnetic responsive nanofibrous composite film was fabricated with poly lactide acid (PLA), hydroxyapatite nanoparticles (nHA) and γ-Fe2O3nanoparticles (γ-Fe2O3NP) using electrospinning technique. The film was folded into a 3D scaffold that suitable for implantation in bone defect sites. The relationship between magnetic properties of composite materials and the percentage of iron oxide magnetic nanoparticles was investigated using vibrating sample magnetometer (VSM). The microstructure of films was observed by scanning electron microscopy (SEM). The effect of magnetic responsive composites on inducing bone repair and regeneration in situ under an applied magnetic field was evaluated in bone transverse process disartitulation model of 12 healthy male New Zealand rabbits after 10,30,50 days implantation. Results indicate that the composite display a strong paramagnetic property and show a positive correlation with the proportion of iron oxide nanoparticles. In an applied magnetic field, the bone tissue regeneration in the disarticulation sites was accelerated with the guidance of the composite scaffold.

bone repair, iron oxide magnetic particles, composite, nanofibrous scaffold

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.010

2015-03-20， 錄用日期:2015-04-30

國家自然科學基金項目(81471793)

R318

A

0258-8021(2015) 03-0330-07

# 中國生物醫(yī)學工程學會會員(Member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: guning@seu.edu.cn；xuhy@pumc.edu.cn