骨軟骨栓液相線跟蹤法處理方案研究

虞效益 張紹志 陳光明,*

1(浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100)2(浙江大學(xué)制冷與低溫研究所，杭州 310027)

骨軟骨栓液相線跟蹤法處理方案研究

虞效益1張紹志2陳光明1,2*

1(浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100)2(浙江大學(xué)制冷與低溫研究所，杭州 310027)

關(guān)節(jié)軟骨的長期保存是臨床上軟骨移植得以廣泛開展的技術(shù)保證。液相線跟蹤法作為一種新型的玻璃化保存方法，是一種很有價值的關(guān)節(jié)軟骨低溫保存技術(shù)。本研究從數(shù)值分析的角度指出了應(yīng)用現(xiàn)有液相線跟蹤法方案處理骨軟骨栓存在的不足，并以避免軟骨細胞在處理過程中遭受冰晶損傷為目標，提出了軟骨直徑6 mm、厚1 mm的骨軟骨栓的液相線跟蹤法處理方案，方案共13步，包括降溫提高濃度、升溫降低濃度兩個過程，共計耗時1012 min。為減少處理時間，采取盡可能降低載入濃度、強化傳質(zhì)過程等措施顯得十分有必要。

關(guān)節(jié)軟骨；玻璃化保存；液相線跟蹤法；傳質(zhì)；數(shù)學(xué)建模

引言

軟骨移植是臨床上修復(fù)、重建和替換受損關(guān)節(jié)軟骨的有效手段，捐獻的軟骨若能長期保存，那么外科醫(yī)生將可針對病變部位挑選合適的移植物，并且有充裕的時間進行多項檢測，以防止供者可能帶來的病毒或細菌感染，這不僅有助于提高軟骨移植手術(shù)的成功率，而且使得軟骨移植手術(shù)的廣泛開展成為可能[1, 2]。玻璃化保存是一種很有希望實現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨長期保存的技術(shù)，到目前為止，關(guān)節(jié)軟骨玻璃化保存的研究雖已取得了相當(dāng)?shù)难芯砍晒鸞3-5]，特別是近來Jomha等報道他們玻璃化保存人關(guān)節(jié)軟骨獲得了75%的軟骨細胞存活率[6]，但要真正應(yīng)用于臨床移植，細胞存活率仍有待進一步提高。玻璃化法實施的難點是如何把高濃度的低溫保護劑載入生物材料，以及突破樣品實際降溫和升溫速率的制約。Pegg等利用低溫保護劑毒性隨溫度降低而降低的特點，提出一邊降低溫度一邊將二甲亞砜載入關(guān)節(jié)軟骨，并始終使溫度略高于組織凍結(jié)點的方法，最終使關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)二甲亞砜達到近60%(w/w)的高濃度，如此高濃度的二甲亞砜也使得實現(xiàn)玻璃化和避免反玻璃化與所需降溫和升溫速率無關(guān)。他們用此玻璃化法保存羊關(guān)節(jié)軟骨獲得了很大成功，并將其命名為“Liquidus-tracking method (LTM)”[7]，文中將其譯成“液相線跟蹤法(LTM)”。

Pegg等的LTM方案是針對特定尺寸(直徑6 mm、厚約1 mm)的不帶有軟骨下骨(subchondral bone)的羊關(guān)節(jié)軟骨片而提出的，而臨床上軟骨移植物的一般形式為帶有軟骨下骨的骨軟骨栓(osteochondral dowels)。Pegg等的方案是否適用于骨軟骨栓有待驗證。本文采用數(shù)值分析的方法，先對現(xiàn)有的LTM方案用于處理骨軟骨栓的可行性進行分析，然后以防止軟骨組織內(nèi)冰晶形成為目的，提出特定尺寸的骨軟骨栓的LTM處理方案。

1 二甲亞砜滲透關(guān)節(jié)軟骨數(shù)學(xué)模型

二甲亞砜處理(加入/取出)關(guān)節(jié)軟骨的過程主要為一擴散傳質(zhì)過程，筆者之前已建立了描述二甲亞砜滲透關(guān)節(jié)軟骨的數(shù)學(xué)模型[8]，此處只對模型作簡要描述。

假設(shè)：1)關(guān)節(jié)軟骨不產(chǎn)生也不消耗二甲亞砜，不存在通過對流方式傳遞的二甲亞砜，不存在溫度和壓力梯度；2)在處理過程中關(guān)節(jié)軟骨不發(fā)生變形；3)關(guān)節(jié)軟骨為一多孔介質(zhì)；4)二甲亞砜在關(guān)節(jié)軟骨中的擴散是各向同性的；5)二甲亞砜在關(guān)節(jié)軟骨中擴散的溫度、濃度依賴性和非理想性與在單純?nèi)芤褐械南嗤?)忽略載入軟骨細胞中的二甲亞砜的量；7)處理溶液是由二甲亞砜和水組成的二元溶液；8)將骨軟骨栓樣品看成是圓柱體，二甲亞砜無法從骨側(cè)滲入/滲出軟骨。

根據(jù)上述假設(shè)，二甲亞砜在關(guān)節(jié)軟骨中的擴散采用下述連續(xù)性方程來描述：

(1)

(2)

式中，Ddw為二甲亞砜在水中的擴散系數(shù)，H為新鮮軟骨含水量，λ為軟骨曲折度因子。對于二元溶液中的擴散，溶質(zhì)在溶劑中的擴散系數(shù)等于溶劑在溶質(zhì)中的擴散系數(shù)，于是有：

Ddw=Dwd

(3)

式中，Dwd為水在二甲亞砜中的擴散系數(shù)。另外，對于二元溶液，各組分的互擴散系數(shù)與溶劑(本文指水)的自擴散系數(shù)存在如下關(guān)系：

(4)

式中，Dw為水在二甲亞砜水溶液中的自擴散系數(shù)，φw為水的體積分數(shù)，μw為水的化學(xué)勢，R為通用氣體常數(shù)，T為溫度。

式(4)中的Dw可通過自由體積模型計算，即

(5)

(6)

(7)

(8)

式中，Mw和Md分別為水和二甲亞砜的相對分子質(zhì)量。Dw,0與濃度有關(guān)，采用如下所示的二次多項式表達：

(9)

式中，a、b和c為常數(shù)。而式(4)中的[△μw/(RT)]T,P項可根據(jù)Flory-Huggins熱力學(xué)理論計算，即：

φw)+

χ(1-φw)2

(10)

(11)

式中，y為相對分子體積，為Flory-Huggins相互作用參數(shù)，和分別為二甲亞砜和水的比體積。

圖1 骨軟骨栓示意圖Fig.1 The schematic diagram of osteochondral dowel

骨軟骨栓樣品為圓柱形，軟骨下骨上方附著直徑D=6 mm、厚H=1 mm的軟骨組織(見圖1)，且軟骨組織為各向同性、均勻一致的材料，故計算區(qū)域取圖1中矩形abcd即可。對于初始條件，假設(shè)新鮮骨軟骨栓中不含二甲亞砜：

wd(z，r，t=0)=0

(12)

式中，z和r分別為軸向坐標和徑向坐標。對于邊界條件，假設(shè)二甲亞砜只可從頂面和側(cè)面滲入軟骨組織，而無法從底面(即骨側(cè))滲入，頂面與側(cè)面的表面濃度等于周圍處理溶液濃度(ws)的0.9倍[9]：

(13)

wd(z=H,r,t)=0.9ws(邊界bc)

(14)

wd(z,r=D/2,t)=0.9ws(邊界cd)

(15)

(16)

模型的求解采用有限元法，所有計算均在COMSOL Multiphysics?軟件中實現(xiàn)，計算區(qū)域的網(wǎng)格劃分如圖2所示(經(jīng)檢驗已足夠密)。模型計算所需的參數(shù)值如表1所示[8]。

圖2 計算區(qū)域和網(wǎng)格劃分Fig.2 Computational area and its meshing

表1模型計算所需參數(shù)值
Tab.1Parametervaluesneededinthemodelcalculation

V^/(mL/g)MTg/KV^*/(mL/g)(K1/γ)/[mL/(g·K)]K2/Kabcχ水118.0151360.911.945×10-3-19.73二甲亞砜0.9178.133154.750.83.66×10-424.11其它0.8237-2.4108-16.5338-0.4617

2 骨軟骨栓的LTM處理方案

Pegg等提出的針對直徑6 mm、厚1 mm的羊關(guān)節(jié)軟骨片的LTM方案如表2所示[7]。應(yīng)用構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型對該方案處理同樣軟骨組織尺寸的骨軟骨栓的可行性進行了數(shù)值分析，其中二甲亞砜溶液的平衡凍結(jié)點采用Pegg提出的公式[10]計算：

tm=A·S+B·S2+C·S3

(17)

式中，tm為平衡凍結(jié)點溫度(℃)，S為總?cè)苜|(zhì)(二甲亞砜+氯化鈉)的濃度(g/100 g)，A、B和C為三個系數(shù)，分別為：

A=-0.6+0.17tan-1(R)

(18)

(19)

C=-0.00045

(20)

式中，R表示二甲亞砜與氯化鈉的質(zhì)量之比。

如圖3所示，在處理溶液溫度低于0℃的冷卻加載步驟中，點a處(見圖1)的二甲亞砜濃度對應(yīng)的平衡凍結(jié)點溫度均要高于處理溶液溫度，即骨軟骨栓處于過冷狀態(tài)，而且過冷度隨著溫度的降低而增大，最大達到約30℃，冰晶將極有可能在軟骨組織內(nèi)形成。因此，對于骨軟骨栓，需要設(shè)計新的處理方案。

表2羊關(guān)節(jié)軟骨片的液相線跟蹤法處理方案

Tab.2TheLTMprotocolforovinearticularcartilagediscs

步驟處理溶液溫度/℃處理溶液濃度/[%(w/w)]處理時間/min冷卻加載階段122101022220103-529304-8.538305-1647306-2356307-3563308-48.57230復(fù)溫洗脫階段1-48.563302-3556303-2347304-1638305-8.529306-52030722045總步數(shù):15步總時間:425min

表3為依據(jù)如下思路而建立的方案。

1)冷卻加載和復(fù)溫洗脫階段各步的處理溶液溫度和處理溶液濃度與現(xiàn)有方案的相同。

2)對于冷卻加載階段的某一步，當(dāng)其接下來一步的處理溶液溫度低于0℃時，該步的處理時間應(yīng)

圖3 冷卻加載和復(fù)溫洗脫階段，處理溶液溫度、骨軟骨栓點a處二甲亞砜濃度及其對應(yīng)的平衡凍結(jié)點溫度隨時間的變化Fig.3 Time courses of the treatment temperature, the concentration of dimethyl sulfoxide at point a of the osteochondral dowel and its corresponding freezing temperature during the stages of cooling-addition and rewarming-removal

步驟處理溶液溫度/℃處理溶液濃度/[%(w/w)]處理時間/min點a處二甲亞砜濃度/[%(w/w)]平衡凍結(jié)點/℃冷卻加載階段122.01010.01.29222.02044.015.73-5.03-5.02966.023.23-8.54-8.53894.432.22-16.05-16.04774.037.62-23.06-23.05697.644.30-357-35.06392.447.50復(fù)溫洗脫階段1-35.05692.42-23.04797.63-16.03874.04-8.52994.45-5.02066.0622.00109.2總步數(shù):13步總時間:1012min

注：表中所給平衡凍結(jié)點數(shù)值根據(jù)每一步加載處理終了，骨軟骨栓點a處二甲亞砜濃度計算得到。

Note：The equilibrium freezing point was calculated from the addition end dimethyl sulfoxide concentration at pointaof the osteochondral dowel for each treatment step.

使得該步終了骨軟骨栓點a處(如圖1)達到的二甲亞砜濃度對應(yīng)的平衡凍結(jié)點溫度等于接下來一步的處理溶液溫度，即軟骨組織不過冷。

3)當(dāng)骨軟骨栓點a處濃度達到47.5%(w/w)時，冷卻加載階段結(jié)束[11]。

4)假設(shè)當(dāng)軟骨組織內(nèi)二甲亞砜的平均濃度降至0.1%(w/w)時，復(fù)溫洗脫階段結(jié)束。

對比表1和表3可以看出，骨軟骨栓的保護劑處理時間遠遠長于軟骨片，其原因在于：1)同樣軟骨體積的骨軟骨栓相比于軟骨片，可滲透表面的面積減少了37.5%；2)骨軟骨栓點a離可滲透表面的距離大于同樣軟骨厚度的軟骨片中心點離表面的距離，即傳質(zhì)距離增大了。

對于傳質(zhì)面積減少、傳質(zhì)距離增大的骨軟骨栓，傳質(zhì)阻力將是液相線跟蹤法的重要制約因素，特別是在低溫下。盡量減少二甲亞砜的載入量，對軟骨內(nèi)二甲亞砜的最終載入濃度進行優(yōu)化研究，能夠縮短LTM的處理時間[11]。另外，也可以設(shè)法加速二甲亞砜滲透關(guān)節(jié)軟骨的過程。對軟骨這種特殊的受力組織，可以考慮采用周期性擠壓法來強化傳質(zhì)過程：軟骨片在被壓縮的過程中排出存在于基質(zhì)間的流體，在接下來的松弛過程中，軟骨片在自身彈力的作用下逐漸恢復(fù)原狀，在此過程中吸入周圍的溶液。在生物力學(xué)領(lǐng)域，就有人通過周期性擠壓法來加速化學(xué)物質(zhì)在軟骨內(nèi)的滲透，如Quinn等采用周期性擠壓法加速右旋糖苷的滲透[12]。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用二甲亞砜滲透關(guān)節(jié)軟骨的數(shù)學(xué)模型，通過數(shù)值分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)現(xiàn)有LTM方案應(yīng)用于同樣軟骨尺寸的骨軟骨栓時將產(chǎn)生較大的過冷度，冰晶將極有可能在軟骨組織內(nèi)形成，為此以避免軟骨細胞在處理過程中遭受冰晶損傷為目標，提出了直徑6 mm、軟骨厚1 mm的骨軟骨栓的LTM處理方案，方案共13步，耗時1 012 min。本研究提出的處理方案以及方案的設(shè)計思路對玻璃化保存骨軟骨栓的成功實施具有一定的指導(dǎo)和參考價值。

[1] 張紹志, 陳光明. 軟骨的低溫保存/移植研究進展[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2007,24(2): 474-476.

[2] Pegg DE, Wusteman MC, Wang Lihong. Cryopreservation of articular cartilage. Part 1: Conventional cryopreservation methods [J]. Cryobiology, 2006,52(3): 335-346.

[3] Song YC, An YH, Kang QK,etal. Vitreous preservation of articular cartilage grafts [J]. Journal of Investigative Surgery, 2004,17(2): 65-70.

[4] Guan J, Urban JPG, Li ZH,etal. Effects of rapid cooling on articular cartilage. Cryobiology, 2006,52(3): 430-439.

[5] Brockbank KGM, Chen ZZ, Song YC. Vitrification of porcine articular cartilage. Cryobiology, 2010,60(2): 217-221.

[6] Jomha NM, Elliott JAW, Law GK,etal. Vitrification of intact human articular cartilage. Biomaterials, 2012,33(26): 6061-6068.

[7] Pegg DE, Wang LH, Vaughan D. Cryopreservation of articular cartilage. Part 3: The liquidus-tracking method [J]. Cryobiology, 2006,52(3): 360-368.

[8] Yu Xiaoyi, Chen Guangming, Zhang Shaozhi. A model for predicting the permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage, and its application to the liquidus-tracking method [J]. Cryobiology, 2013,67(3): 332-338.

[9] Mukherjee IN, Li Y, Song YC,etal. Cryoprotectant transport through articular cartilage for long-term storage: experimental and modeling studies [J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2008,16(11): 1379-1386.

[10] Pegg DE. Equations for obtaining melting points and eutectic temperature for the ternary system dimethyl sulphoxide/sodium chloride/water [J]. CryoLetters, 1986,7: 387-394.

[11] Yu Xiaoyi, Chen Guangming, Zhang Shaozhi. A refinement to the liquidus-tracking method for vitreous preservation of articular cartilage [J]. CryoLetters, 2013,34(3): 267-276.

[12] Quinn TM, Studer C, Grodzinsky AJ,etal. Preservation and analysis of nonequilibrium solute concentration distribution within mechanically compressed cartilage explants [J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2002,52(2): 83-95.

Study on Treatment of Osteochondral Dowels by Liquidus-tracking Method

Yu Xiaoyi1Zhang Shaozhi2Chen Guangming1,2*

1(Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, Zhejiang, China)2(Institute of Refrigeration and Cryogenics, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

articular cartilage; vitrification; liquidus-tracking method; mass transfer; mathematical modeling

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.017

2014-09-17， 錄用日期：2014-11-17

國家自然科學(xué)基金(51406180)；中國科學(xué)院低溫工程學(xué)重點實驗室開放基金(CRYO201416)；浙江省教育廳科研項目(Y201432759)

R318.52

D

0258-8021(2015) 03-0376-05

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: gmchen@zju.edu.cn