農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬爾尼菲青霉基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立及優(yōu)化

李鑫壘　李昕　曹存?。ǎ畯V西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧5300；．常德市第一人民醫(yī)院皮膚性病科，常德45000）

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬爾尼菲青霉基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立及優(yōu)化

李鑫壘1李昕2曹存巍1
（1．廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧530021；2．常德市第一人民醫(yī)院皮膚性病科，常德415000）

目的建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬爾尼菲青霉（PM）基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，并對該技術(shù)條件進行優(yōu)化。方法以二元質(zhì)粒pDHt／SK為載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pyrG基因插入馬爾尼菲青霉尿嘧啶缺陷株SPM4（pyrG?，niaD?）中，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。運用PCR驗證重組子。進一步對影響轉(zhuǎn)化效率的農(nóng)桿菌類型、共培養(yǎng)濃度、轉(zhuǎn)化媒介、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮（AS）等六個條件進行優(yōu)化。結(jié)果PCR驗證pyrG基因成功的插入SPM4中，所得到轉(zhuǎn)化子可穩(wěn)定傳代，通過條件優(yōu)化，得到轉(zhuǎn)化子約300個／106個細胞。選用AGL?1，以農(nóng)桿菌共培養(yǎng)濃度為OD600＝0．8，AS濃度為200 μmol／L，無膜IM固體共培養(yǎng)基為介質(zhì)，25℃共培養(yǎng)48 h為最適轉(zhuǎn)化條件。結(jié)論成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)PM基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，簡化并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件，該方法可用于PM基因功能研究。

馬爾尼菲青霉；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化

［Chin J Mycol，2015，10（2）：88?91］

隨著馬爾尼菲青霉病（Penicilliosis marneffei，PSM）的發(fā)病率不斷升高，PSM發(fā)病機制成為當(dāng)前國內(nèi)外研究熱點［1］。對馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）基因功能的研究是闡明其具體致病機制的有效途徑?；蚬δ苎芯康姆椒ㄖ皇墙⒒蜣D(zhuǎn)化技術(shù)技術(shù)。目前PM基因轉(zhuǎn)化最常用的方法是原生體轉(zhuǎn)化法，但操作復(fù)雜、穩(wěn)定性差，而由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacte?rium tumefaciens mediated transformation，ATMT）技術(shù)［2］具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定等特點［3］，已成功應(yīng)用于其他絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)化。本實驗擬構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)PM高效基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，對轉(zhuǎn)化體系進行簡化并優(yōu)化，實現(xiàn)PM基因高效優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)化。

1　材料與方法

1．1材料

實驗菌株P(guān)M尿嘧啶缺陷株SPM4（pyrG?，niaD?）及其母本菌株FRR2161，均由澳大利亞墨爾本大學(xué)Alex Andrianopoulous教授惠贈。根癌農(nóng)桿菌EHA105（攜利福霉素、鏈霉素抗性）及AGL?1（利福霉素、羧芐青霉素抗性）由本實驗室保存。

質(zhì)粒pDHt／SK：：pyrG質(zhì)粒，含卡那霉素抗性篩選標記及pyrG基因，本實驗室前期工作中獲得。質(zhì)粒pLAX223為篩選標記pyrG來源。

主要試劑硝酸纖維膜購自上海金標公司，DNA提取試劑盒購自上海生工公司，乙酰丁香酮（AS）購自ALDRICH公司。

1．2方法

菌株的活化將含有質(zhì)粒Pdht／SK：：pyrG的農(nóng)桿菌菌株EHA105、AGL?1分別接種在LB平板上（含卡那霉素50 μg／L，利福平200 μg／L），28℃暗培養(yǎng)，多次劃線分離單克隆菌株。

真菌孢子懸液的制備將SPM4接在SDU斜面培養(yǎng)基上，每7～10 d傳代1次，使其有足夠的孢子產(chǎn)生。用基本培養(yǎng)基（MM）沖洗孢子，紅細胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為5×106個／mL。

予誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）液基調(diào)整農(nóng)桿菌濃度將農(nóng)桿菌OD600分別調(diào)整為0．6、0．7、0．8、0．9、1．0；取預(yù)先備好PM孢子，與農(nóng)桿菌等體積混合；將混合物涂于共培養(yǎng)介質(zhì)上分別以28℃、25℃暗培養(yǎng)24／48／72 h（三種不同的共培養(yǎng)介質(zhì)：硝化纖維素膜＋IM固體培養(yǎng)基；IM固體培養(yǎng)基；IM液態(tài)靜置。共培養(yǎng)基中不加AS或加入AS濃度分別調(diào)整為50、100、200、300、400 μmol／L）；于SD篩選培養(yǎng)基（含200 μg／L頭孢塞肟，不含尿嘧啶）篩選陽性轉(zhuǎn)化子，多次轉(zhuǎn)代，以純化轉(zhuǎn)化子。

轉(zhuǎn)化子PCR驗證從SD培養(yǎng)基上刮取少量菌絲，按照上海生工DNA提取試劑盒說明提取DNA；PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10min 4℃保存。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳。

2　結(jié)　果

2．1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PM轉(zhuǎn)化

將pDHt／SK：：pyrG通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，其可在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長（見圖1）。將含有pDHt／SK：：pyrG的農(nóng)桿菌濃度調(diào)整至OD600＝0．8和PM孢子懸液共培養(yǎng)，并于SD篩選培養(yǎng)基（含200 μg／L頭孢塞肟，不含尿嘧啶）篩選陽性轉(zhuǎn)化子。得到SPM4陽性轉(zhuǎn)化菌株在無尿嘧啶的SD培養(yǎng)基上生長良好（見圖2）。以陽性轉(zhuǎn)化株DNA模板，用pyrG上下游引物行PCR擴增后，在1 200 bp處出現(xiàn)陽性條帶，證實pyrG基因成功的整合SPM4（見圖3）。將轉(zhuǎn)化子接種在尿嘧啶缺陷的SD培養(yǎng)基上連接傳代6次后，轉(zhuǎn)化子仍然生長良好，且生物學(xué)性狀無明顯改變，PCR仍能檢測到pyrG插入片段的存在，表明ATMT方法獲得PM突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2．2轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

農(nóng)桿菌類型、濃度對轉(zhuǎn)化率的影響農(nóng)桿菌AGL?1較EHA105轉(zhuǎn)化效率更高，當(dāng)農(nóng)桿菌OD600＝0．6、0．7時較化效率較低，OD600＝0．8時轉(zhuǎn)化效率達到最高，而當(dāng)OD600＝0．9、1．0時轉(zhuǎn)化效率則有降低趨勢（見圖4）。

不同的共培養(yǎng)介質(zhì)對轉(zhuǎn)化效率的影響以IM液體為共培養(yǎng)介質(zhì)未得到轉(zhuǎn)化子；而硝化纖維膜或無膜的IM固體共培養(yǎng)基為介質(zhì)能成功的實驗轉(zhuǎn)化，且二者的轉(zhuǎn)化效率無明顯差異。而直接將混合物涂于IM固體培養(yǎng)基省去了硝酸纖維素膜這一介質(zhì)，更節(jié)省耗材，因此最合適PM轉(zhuǎn)化。

AS對轉(zhuǎn)化效率的影響在無AS存在情況下，得不到轉(zhuǎn)化子。AS在50～200 μmol／L范圍內(nèi)，所得轉(zhuǎn)化子隨AS隨濃度增高而增高，200 μmol／L時達到最高，當(dāng)AS的濃度濃度升高至300、400 μmol／L反而引起轉(zhuǎn)化效率降低，同時200 μmol／L所得到的轉(zhuǎn)化子背景較少，易篩選（見圖5）。

共培養(yǎng)時間及溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響共培養(yǎng)24 h可見少數(shù)幾個轉(zhuǎn)化子，隨著共培養(yǎng)時間的增加至48 h，能得到較多的轉(zhuǎn)化子，但當(dāng)72 h，陽生轉(zhuǎn)化子過多，不利于篩選。農(nóng)桿菌在28℃較25℃共培養(yǎng)易出現(xiàn)過生長，影響轉(zhuǎn)化子的生長，不利于轉(zhuǎn)化子進一步純化。因此25℃更適合PM轉(zhuǎn)化（見圖6）。

圖1　農(nóng)桿菌在含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長　圖2　陽性轉(zhuǎn)化株　圖3　陽性轉(zhuǎn)化株P(guān)CR電泳圖：泳道1．MARK，泳道2～10．轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物　圖4　共培養(yǎng)濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響　圖5　AS的濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響　圖6　共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效率的影響Fig．1　A．tumefaciens grow in the medium containing kanamycin　Fig．2　Positive transformants　Fig．3　Positive Transformats PCR electrophoresis：Lane 1．The MARK，Lane 2?10．Positive transformats of PCR　Fig．4　The influence of cocultivation concentration on the fransform efficiency　Fig．5 The influence of AS concentration on the fransform efficiency　Fig．6　The influence of cocultivation time on the fransform efficiency

3　討　論

大多數(shù)微生物功能基因組學(xué)研究的前提是獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，目前馬爾尼菲青霉DNA轉(zhuǎn)化最常用的方法是CaCL2?PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，該方法可獲得約140／106轉(zhuǎn)化子，但操作較復(fù)雜［4］。ATMT方法簡單、效率高、成本低，已被大量應(yīng)用于絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化研究中［3］，但國內(nèi)外應(yīng)用該法進行PM基因研究的報道較少，如何優(yōu)化ATMT條件，提高PM的DNA轉(zhuǎn)化效率，更好的應(yīng)用于PM基因功能研究是亟待解決的問題。本研究在成功建立ATMT轉(zhuǎn)化PM的技術(shù)基礎(chǔ)上，對影響轉(zhuǎn)化效率的因素進行了深入研究。

農(nóng)桿菌菌株毒力是影響ATMT轉(zhuǎn)化效率的重要因素［5］。Zhang P等［6］發(fā)現(xiàn)高毒力的EHA105比LBA4404更適合PM轉(zhuǎn)化，而本實驗發(fā)現(xiàn)毒力更高的AGL?1比EHA105轉(zhuǎn)化效率更高。

誘導(dǎo)劑是影響ATMT成功轉(zhuǎn)化的另一重要因素。我們對常用誘導(dǎo)劑AS不同濃度的誘導(dǎo)效率進行研究，結(jié)果顯示，農(nóng)桿菌與PM共培養(yǎng)未加AS沒有得到轉(zhuǎn)化子。加入AS后所得轉(zhuǎn)化子隨AS隨濃度增高而增高，AS濃度為200 μmol／L時達到最高，繼續(xù)升高反而引起轉(zhuǎn)化效率降低，與Zhang P［6］等選擇的AS濃度一致。我們還觀察到，預(yù)培養(yǎng)時是否加入AS對于ATMT介導(dǎo)的PM轉(zhuǎn)化效率無明顯影響，這與龍朝欽在煙曲霉的研究中所到的結(jié)果相似［7］。

同時本研究對比了不同的共培養(yǎng)介質(zhì)對AT? MT轉(zhuǎn)化效率的影響。Sugui等［8］認為液體培養(yǎng)基較硝酸纖維膜是一種更有效轉(zhuǎn)化煙曲霉的共培養(yǎng)介質(zhì)，而本實驗中，IM液態(tài)靜置培養(yǎng)法未得到轉(zhuǎn)化子。這說明針對不同的受體真菌選擇合適的共培養(yǎng)介質(zhì)，對于成功的實驗ATMT轉(zhuǎn)化很重要［9］。

農(nóng)桿菌與受體細胞數(shù)的濃度影響ATMT轉(zhuǎn)化效率［10］。本實驗參考國外文獻［6，11］，以PM孢子數(shù)為5×106個／mL為前提，在一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率隨農(nóng)桿菌濃度升高而增高，當(dāng)OD600＝0．8時轉(zhuǎn)化效率達到最高，而當(dāng)濃度繼續(xù)升高時轉(zhuǎn)化效率則有降低趨勢，分析可能的原因是因為農(nóng)桿菌濃度低時，轉(zhuǎn)化的受體孢子有限；濃度過高時，生長過快，不利于轉(zhuǎn)化子生長［7］。共培養(yǎng)溫度和時間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素，共培養(yǎng)時間太短，農(nóng)桿菌未完成轉(zhuǎn)化而得不到轉(zhuǎn)化子；時間太長不僅會引起農(nóng)桿菌過多的生長，且不利于插入的外源基因的表達［12］。過高的溫度造成農(nóng)桿菌侵染力下降［5］。最終確定25℃共培養(yǎng)48 h，對于PM轉(zhuǎn)化最佳。

綜上所述，ATMT是一種有效的介導(dǎo)馬爾尼菲青霉遺傳轉(zhuǎn)化的方法，由AGL?1的轉(zhuǎn)化主體（OD600＝0．8），PM孢子為轉(zhuǎn)化受體（孢子數(shù)＝5× 106個／mL），pDHt／SK為載體，尿嘧啶缺陷作篩選標記所構(gòu)成的ATMT轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在AS濃度為200 μmol／L，25℃共培養(yǎng)48 h后得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。與國外報道的PM遺傳轉(zhuǎn)化相比，本實驗以營養(yǎng)為篩選標記，相比抗生素篩選能夠避免假陽性子的出現(xiàn)；同時直接將混合物涂于IM固體培養(yǎng)基上，省去了硝酸纖維素膜，減少實驗耗材，簡化并優(yōu)化了ATMT轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

［1］李凌華，唐小平，胡鳳玉．馬爾尼菲青霉菌的分子學(xué)研究進展［J］．國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2009，36（4）：251?254．

［2］Michielse CB，Hooykaas PJ，van den Hondel CA，et al．Agrobac?terium mediated transformation of the filamentous fugus Aspergil?lus awamor［J］．Nat Protoc，2008，3（10）：1671?1678．

［3］Zheng Z，Huang C，Cao L，Xie C，et al．Agrobacterium tumefa?ciens?mediated transformation as a tool for insertional mutagene?sis in medicinal fungus Cordyceps militaris［J］．Fungal Biol，2011，115（3）：265?274．

［4］Borneman AR，Hynes MJ，Andrianopoulos A．An STE12 homolog from the asexual，dimorphic fungus Penicillium marneffei com?plements the defect in sexual development of an Aspergillus nidulans steA mutant［J］．Genetics，2001，157（3）：1003?1014．

［5］錢科，胡昌華．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的影響因子研究進展［J］．中國醫(yī)藥指南，2012，3（10）：371?373．

［6］Zhang P，Xu B，Wang Y，et al．Agrobacterium tumefaciens?medi?ated transformation as a tool for insertional mutagenesis in the fungus Penicillium marneffei［J］．Mycological research，2008，112（8）：943?949．

［7］龍朝欽，鄧軍，郝飛，等．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙曲霉轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化［J］．西部醫(yī)學(xué)，2008，20（20）：261?264．

［8］Sugui JA，Chang YC，Kwon?Chung KJ，et al．Agrobacterium tume?faciens?mediated transformation of Aspergillus fumigatus：an effi?cient tool for insertional mutageneisis and targeted gene disrupion［J］．Appl Environ Mircrobiol，2005，71（4）：1781?1802．

［9］Figueiredo J，Goulin E，Tanaka F，et a1．Agrobacterium tumefa?ciens?Mediated transformation of Guignardia citricarpa［J］．J Mi?crobiol Methods，2010，80（2）：143?147．

［10］Marchand G，F(xiàn)orticr E，Neven B，et al．Alternative methods or genetic transformation of Pseudozana antarctica，a Basidio myce?tous yeast?like fungus［J］．J Microbiol Method，2007，70（3）：519?527．

［11］Leclerque A，Wan H，Abschutz A，et al．Agrobacterium?mediated insertional mutagenesis（AIM）of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana［J］．Curr Genet，2004，45（2）：111?119．

［12］沈衛(wèi)鋒，翁宏飚，牛寶龍，等．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的灰葡萄孢菌遺傳轉(zhuǎn)化研究［J］．遺傳，2008，30（4）：515?520．

［本文編輯］施慧

To establish and optimize the genetic transformation technology of Penicillium marneffei by Agrobacterium tumefaciens?mediated transformation

LI Xin?lei1，LI Xin2，CAO Cun?wei1
（1．Department of Dermatology and Venereology，The First Affiliated hospital ofGuangxi Medical University，Naning 530021，China；2．Department of Dermatology and Venereology，The First People’s Hospital of Changde，Changde 415000）

ObjectiveTo construct and optimize the condition of Agrobacteriumtumefaciens?mediated transformattechology in Penicillium marneffei．MethodA．tumefaciens transformed by Calcium chloride with pDHt／SK：：pyrG plasmids insert pyrG gene into SPM4（pyrG?，niaD?），medium without uracil screening positive transformat，Using PCR verification restructuring．It aimed at finding out the optimal protocol by changing some important effecting factors including A．tumefaciens strains，concentration，transformat medi?um，co?cultivation temperature，period，AS．The positive transformant growed well in the media without uracil，and PCR analysis showed that T?DNA was inserted into the transformants．ResultThe transformation efficiency was about 300 transformants／106spores by optimizing．The optimal condition for AGL?1，concentration of A．tumefaciens OD600＝0．8，the AS concentration of 200 μmol／L，without nitrocellulose filters，co?culture 48 h in 25℃．ConclusionA．tumefaciens?mediated transformattechology in P．marneffei．was successfully established，simplified and optimized．The method can be used for PM gene function research．

Penicillium marneffei；Agrobacterium tumefaciens；transformation

R 379．9

A

1673?3827（2015）10?0088?04

國家自然科學(xué)基金（81060128，81271804）；廣西自然科學(xué)基金（0991144，2012jjAA40175）；廣西衛(wèi)生廳自籌課題（Z2007082）

李鑫壘，男（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：3024270＠163．com

曹存巍，E?mail：caocunwei＠yeah．net

2014?12?13