轉(zhuǎn)錄因子RPN4對(duì)白念珠菌藥物敏感性的研究

許洪濤　唐若愚　屈鶯歌　王曉娟　姜遠(yuǎn)英　曹永兵　顏天華（．中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京98；．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海004；．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海006）

轉(zhuǎn)錄因子RPN4對(duì)白念珠菌藥物敏感性的研究

許洪濤1，2唐若愚3屈鶯歌1，2王曉娟1，2姜遠(yuǎn)英2曹永兵2顏天華1
（1．中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京211198；2．第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海200433；3．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

目的利用基因缺失菌庫(kù)研究轉(zhuǎn)錄因子敲除后對(duì)白念珠菌藥物敏感性的影響，并利用藥物敏感性差異菌株初步考察可能的耐藥性調(diào)控機(jī)制。方法微量液基稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）；點(diǎn)板法（spot assay）和生長(zhǎng)曲線法驗(yàn)證菌株對(duì)氟康唑的敏感性；實(shí)時(shí)定量PCR（RT?PCR）法檢測(cè)藥物敏感性差異菌株中多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)，并通過(guò)羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)測(cè)定外排能力。結(jié)果親本菌SN250對(duì)氟康唑表現(xiàn)為耐藥，多藥耐藥基因CDR1和MDR1高表達(dá)，MIC80大于16 μg／mL，大部分轉(zhuǎn)錄因子缺失菌與親本菌SN250表現(xiàn)出相同的耐藥性，但轉(zhuǎn)錄因子RPN4缺失菌株對(duì)氟康唑的敏感性升高，MIC80降為0．5 μg／mL；多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)均降低，20min和40min時(shí)對(duì)羅丹明6G的外排能力降低。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子RPN4有可能通過(guò)促進(jìn)多藥耐藥基因CDR1和MDR1表達(dá)和菌株外排能力而降低對(duì)藥物的敏感性，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

白念珠菌；轉(zhuǎn)錄因子；藥物敏感性；多藥耐藥基因

［Chin J Mycol，2015，10（2）：75?79］

近年來(lái)，隨著免疫功能受損患者（接受放療、化療、器官移植治療的患者以及艾滋病患者）的增加，廣譜抗生素和免疫抑制劑的長(zhǎng)期廣泛使用，導(dǎo)致真菌感染特別是深部真菌感染呈上升趨勢(shì)。在中國(guó)，念珠菌導(dǎo)致的深部感染已經(jīng)居首位［1］。而大多數(shù)抗真菌藥物都是在上世紀(jì)合成的，長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用導(dǎo)致了大量耐藥菌株的產(chǎn)生，導(dǎo)致臨床治療的失敗。

隨著分子生物學(xué)的興起和發(fā)展，人們對(duì)于白念珠菌耐藥性的研究已經(jīng)擴(kuò)展到分子水平，對(duì)于耐藥的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究也逐漸成為熱門(mén)課題，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，對(duì)白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控作用的研究取得了許多進(jìn)展，包括從黏附、菌絲的形成到對(duì)宿主內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)等過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Aft2與白念珠菌的黏附有關(guān)，敲除后導(dǎo)致細(xì)胞表面疏水性增加，細(xì)胞間的絮結(jié)作用增強(qiáng)以及黏附到聚苯乙烯表面的能力增強(qiáng)［2］；轉(zhuǎn)錄因子Sfl1負(fù)向調(diào)節(jié)菌絲形成，其過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致菌絲形成的顯著減少［3］；在宿主體內(nèi)，白念珠菌通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Sfu1、Sef1和Hap43構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)鐵平衡從而適應(yīng)環(huán)境中鐵含量的變化［4］；轉(zhuǎn)錄因子Pho4與白念珠菌對(duì)磷酸鹽限制性條件的感受有關(guān)，當(dāng)敲除后在較低的磷酸鹽條件下表現(xiàn)出菌絲過(guò)度生長(zhǎng)，且毒力增加［5］；白念珠菌在不同營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)激條件下所表現(xiàn)的表型差異與轉(zhuǎn)錄因子之間也存在密切聯(lián)系［6］。此外，Rlm1與細(xì)胞壁生物合成有關(guān)［7］，Upc2與耐藥性有關(guān)［8］，轉(zhuǎn)錄因子在生物被膜的形成過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用［9］。

本研究的目的在于篩選不同轉(zhuǎn)錄因子缺失菌對(duì)藥物敏感性的差異，并利用對(duì)藥物敏感性有差異的缺失菌初步考察白念珠菌的耐藥機(jī)制。通過(guò)微量液基稀釋法對(duì)30株轉(zhuǎn)錄因子敲除菌進(jìn)行藥物敏感性篩選，然后用生長(zhǎng)曲線和spot assay驗(yàn)證敲除菌對(duì)氟康唑的耐受能力，用實(shí)時(shí)定量PCR（RT?PCR）法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子敲除菌中多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)情況，并通過(guò)對(duì)羅丹明6G的外排考察這些耐藥蛋白的外排能力，從而初步探討轉(zhuǎn)錄因子與藥物敏感性之間的調(diào)控機(jī)制。

1　材料和方法

1．1實(shí)驗(yàn)菌株與藥敏檢測(cè)

國(guó)際實(shí)驗(yàn)室通用菌株白念珠菌（Candida albicans）ATCCMYA?2876（SC5314）由美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)免疫微生物教研室（Department of Mi?crobiology and Immunology，Georgetown University，Washington，U．S．A．）的William A．Fonzi教授饋贈(zèng)。親本菌SN250和30株白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子敲除菌由上海生命科學(xué)院巴斯德研究所陳昌斌教授惠贈(zèng)，詳見(jiàn)表1。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的M27?A微量液基稀釋法測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氟康唑的MIC80。

表1　30株轉(zhuǎn)錄因子敲除菌以及轉(zhuǎn)錄因子的名稱(chēng)Tab．1　The 30 strains transcription factor knocked out Candida albicans and the names of the transcription factors

1．2培養(yǎng)基

RPMI1640培養(yǎng)液：RPMI1640 10 g，NaHCO32．0 g，嗎啉基丙磺酸34．5 g，加三蒸水900mL溶解，1 mol／LNaOH調(diào)pH至7．0，三蒸水定容至1 000mL，0．22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（SDA）：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900mL溶解，加入2 mg／mL氯霉素水溶液50mL，調(diào)整pH至7．0，以三蒸水定容至1 000mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩＝湍附嗟鞍纂似咸烟牵╕EPD）培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900mL溶解，加入2 mg／mL氯霉素水溶液50mL，三蒸水定容至1 000mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）：NaCl 8．0 g，KCl 0．4 g，Na2HPO40．133 g，KH2PO40．06 g，NaHCO30．35 g，加三蒸水900mL溶解并定容至1 000mL，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3主要試劑

氟康唑氯化鈉注射液（fluconazole，F(xiàn)LC，Pfi?zer），咪康唑（miconazole，MCZ，Sigma），真菌RNAout制劑盒（北京天恩澤基因科技有限公司），Prime Script RT Master Mix（TakaRa），SYBR Premix EX Taq（TakaRa），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1．4儀器與裝置

T?gradient PCR儀、熒光定量real?time PCR儀（Bio?Rad）；Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測(cè)儀（Lab?system）；MJX型智能霉菌培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠制造）；Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)（Ep?pendorf）。

1．5spot assay實(shí)驗(yàn)

首先澆鑄含藥的YEPD平板：將配制的YEPD高壓滅菌，待培養(yǎng)液冷卻至不燙手后加入藥物，使氟康唑（FLC）和咪康唑（MCZ）的最終濃度均達(dá)到4 μg／mL和8 μg／mL，徹底混勻后倒入無(wú)菌的平皿上，靜置冷卻。將菌株在YEPD培養(yǎng)液中分別連續(xù)活化2次達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期后期，3 000×g離心5min，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用YEPD培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度為1×107cell／mL，10倍比稀釋得到5個(gè)濃度梯度，即1×107cell／mL、1×106cell／mL、1×105cell／mL、1×104cell／mL、1×103cell／mL，取10μL菌液點(diǎn)在含藥平板上，于30℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌株在平板上的生長(zhǎng)情況并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1．6生長(zhǎng)曲線

將白念珠菌以1∶100接種至1mL YEPD培養(yǎng)液，于30℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)16 h，活化兩次，使真菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期。用酶標(biāo)儀測(cè)600 nm處的OD值，以YEPD培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整菌液濃度至OD600值為0．1，分別于5mL上述菌液中加入氟康唑，使藥物的最終濃度為16 μg／mL。30℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、28和32 h時(shí)間點(diǎn)取樣100μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值，以O(shè)D600值確定菌株生長(zhǎng)變化。

1．7RT?PCR考察多藥耐藥基因CDR1和MDR1表達(dá)水平

采用真菌RNAout試劑盒進(jìn)行總RNA抽提，用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，使其OD260／OD280值介于1．8和2．1之間，并對(duì)RNA進(jìn)行定量。

RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA反轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液體系為5×PrimeScript RT Master Mix 2μL，RNA 500 ng，加RNase Free dH2O至20μL，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件為37℃15min，85℃5 s，4℃冷卻。

RT?PCR反應(yīng)引物序列詳見(jiàn)表2，TR?PCR的反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，50× ROX Reference DyeⅡ0．4μL，Primer F 0．4μL，Primer R 0．4μL，cDNA 2μL，滅菌水6．8μL，反應(yīng)體系共20μL。RT?PCR的反應(yīng)條件為95℃1min；95℃10 s，循環(huán)40次；60℃20 s，循環(huán)40次；72℃30 s，循環(huán)40次；冷卻至室溫。

反應(yīng)結(jié)束后記錄終止循環(huán)閾值（cycle thresh?old，Ct），用內(nèi)參actin的Ct值校正目的基因Ct值，得到ΔCt，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ΔCt得到ΔΔCt，基因表達(dá)比值（實(shí)驗(yàn)組／對(duì)照組）Ratio＝2?ΔΔCt。

表2　引物序列和名稱(chēng)Tab．2　The sequence of primers used in this study

1．8羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)

按照上述方法活化菌株使其處于指數(shù)生長(zhǎng)期后期，3000×g離心5min，用PBS洗3次除去培養(yǎng)液，用PBS調(diào)整使菌液的OD600值為0．5。將菌液在30℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)2 h，消耗細(xì)胞內(nèi)的能量，加入終濃度為10 μg／mL的羅丹明6G，30℃，200 r／min振蕩培養(yǎng)0．5 h后用PBS洗3次，除去細(xì)胞外的羅丹明6G，加入終濃度為2 mg／mL的葡萄糖并開(kāi)始計(jì)時(shí)。在20min和40min吸取1mL菌液，離心后檢測(cè)上清液PBS中的熒光強(qiáng)度，記錄并做圖。

1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0．05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2．1藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)微量液基稀釋法對(duì)30株轉(zhuǎn)錄因子敲除菌進(jìn)行初步篩選，編號(hào)為CC003（轉(zhuǎn)錄因子RPN4缺失）的菌株對(duì)氟康唑敏感性顯著升高（以下統(tǒng)稱(chēng)RPN4缺失菌），其MIC80＜0．5 μg／mL。另外，編號(hào)為CC001、CC011、CC015、CC016、CC020、CC027、CC029的菌株對(duì)氟康唑的敏感性也增加，MIC80為8 μg／mL，編號(hào)為CC023的菌株的MIC80降低到4 μg／mL，篩選結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　白念珠菌轉(zhuǎn)錄因子敲除菌對(duì)氟康唑的敏感性Tab．3　The susceptibility of transcription factor knocked out Candida albicans to fluconazole

2．2spot assay實(shí)驗(yàn)

與親本菌SN250相比，RPN4缺失菌在YEPD固體培養(yǎng)基上對(duì)4 μg／mL和8 μg／mL氟康唑和咪康唑均表現(xiàn)得更加敏感（見(jiàn)圖1）。

2．3生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明16 μg／mL氟康唑?qū)PN4缺失菌的抑制作用更明顯，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)錄因子RPN4敲除后菌株對(duì)氟康唑變得更敏感（見(jiàn)圖2）。

2．4SC5314、SN250和RPN4缺失菌中CDR1和MDR1的表達(dá)

根據(jù)RT?PCR實(shí)驗(yàn)獲得的Ct值和計(jì)算獲得的Ratio值可知：SC5314和RPN4缺失菌中多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)都低于SN250（見(jiàn)圖3）。

2．5羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)

在20min和40min時(shí)，SN250對(duì)羅丹明6G的外排能力都明顯高于RPN4缺失菌（見(jiàn)圖4）。

3　討　論

目前，臨床上廣泛使用的抗真菌藥物尤其是唑類(lèi)藥物耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，而真菌耐藥性的產(chǎn)生涉及多種機(jī)制，典型的包括：多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)增加；藥物靶酶的變異；生物被膜的形成等［10］。轉(zhuǎn)錄因子RPN4在釀酒酵母和白念珠菌中都有同源物，能夠調(diào)節(jié)蛋白酶體基因的表達(dá)［11］，在重金屬、滲透應(yīng)激和氧化應(yīng)激下表達(dá)增加［12］。而研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激能夠上調(diào)MDR1的表達(dá)，從而導(dǎo)致白念珠菌產(chǎn)生耐藥性［13］。根據(jù)這些研究和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出了這樣一個(gè)假設(shè)：氧化應(yīng)激可能先上調(diào)RPN4的表達(dá)，而RPN4表達(dá)的增加又導(dǎo)致MDR1表達(dá)增加，而這個(gè)假設(shè)是否正確還有待繼續(xù)研究。

本研究通過(guò)微量液基稀釋法、spot assay實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)都證明了與親本菌SN250相比，轉(zhuǎn)錄因子RPN4敲除后導(dǎo)致對(duì)氟康唑的敏感性明顯升高，表明這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與白念珠菌對(duì)藥物敏感性的調(diào)節(jié)。為進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，利用RT?PCR對(duì)RPN4缺失菌中多藥耐藥基因CDR1和MDR1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在RPN4缺失菌中CDR1和MDR1的表達(dá)均低于親本菌SN250。羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從功能方面驗(yàn)證了這些多藥耐藥蛋白外排能力的降低。耐藥基因表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)藥物的敏感性升高，這些耐藥基因的表達(dá)降低可能與RPN4缺失菌對(duì)氟康唑的敏感性升高有關(guān)。

圖1　點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)結(jié)果：a．YEPD＋4 μg／mL氟康唑，b．YEPD＋8 μg／mL氟康唑，c．YEPD＋4 μg／mL咪康唑，d．YEPD＋8 μg／mL咪康唑　圖2　生長(zhǎng)曲線結(jié)果：a．不加藥空白組，b．16 μg／mL氟康唑組　圖3　SC5314、SN250和CC003中CDR1和MDR1的表達(dá)　圖4　SN250和CC003對(duì)羅丹明6G的外排實(shí)驗(yàn)Fig．1　The results of spot assay：a．YEPD＋4 μg／mL fluconazole，b．YEPD＋8 μg／mL fluconazole，c．YEPD＋4 μg／mL miconazole，d．YEPD＋8 μg／mL miconazole　Fig．2　The results of growth curve：a．Control group，b．16 μg／mL fluconazole group　Fig．3　The expression of the multidrug resistance genes CDR1 and MDR1 in Candida albicans SC5314，SN250 and strain CC003（n＝3，±s，SN250 vs CC003，?P＜0．05）　Fig．4　The ability of Candida albicans SN250 and CC003 to pump out rhodamine 6G（n＝3，±s，SN250 vs CC003，??P＜0．01，?P＜0．05）

本研究探討轉(zhuǎn)錄因子RPN4敲除后與藥物敏感性之間的聯(lián)系及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RPN4缺失后導(dǎo)致耐藥基因CDR1和MDR1表達(dá)降低從而導(dǎo)致缺失菌的藥物敏感性升高。然而，白念珠菌對(duì)藥物敏感性的調(diào)節(jié)涉及多種機(jī)制，對(duì)于其具體的調(diào)控過(guò)程還有待于進(jìn)一步研究。

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［本文編輯］施慧

Analysis of relationship between transcription factor RPN4 and drug susceptibility of Candida albicans

XU Hong?tao1，2，TANG Ruo?yu3，QU Ying?ge1，2，WANG Xiao?juan1，2，JIANG Yuan?ying2，CAO Yong?bing2，YAN Tian?hua1
（1．College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198；2．New Drug Research and Development Center，College of Pharmacy，The Second Military Medical University，Shanghai 200433；3．College of Food Science and Technology，ShangHai Ocean University，Shanghai 201306）

ObjectiveTo study the influence on the drug susceptibility of Candida albicans after transcription factor RPN4 was knocked out and the mechanism how this transcription factor regulates the drug susceptibility in Candida albicans．MethodsThe broth microdilution method was used to determine theminimal inhibitory concentrations（MICs）of 30 strains transcription factor knocked out Candida albicans．The drug susceptibility was reassured by spot assay and growth curve．The total RNA of parental strain SN250 and susceptible strains were extracted and the expression of multidrug resistance genes CDR1 and MDR1 was determined by real?time PCR，and the pump ability was examined by the ability of pump out rhodamine 6G．ResultsCompaired to the parental strain SN250，transcription factor RPN4 knocked out strain was more susceptible to fluconazole．The expression of CDR1 and MDR1 was lower than SN250 and the pump ability was also weaker than SN250．ConclusionThe knockout of transcription factor PRN4 re?sults susceptible to fluconazole in Candida albicans，and this transcription factor may be involved in the regulation of drug susceptibil?ity in Candida albicans．

Candida albicans；transcription factors；drug susceptibility；multidrug resistance genes

R 379．4

A

1673?3827（2015）10?0075?05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81173100），上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)課題（11JC1415400）

許洪濤，男（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：xhthfut＠163．com

顏天華，E?mail：18915991229＠126．com

2015?03?13