近平滑念珠菌形態(tài)多樣性及毒力因子的分泌活性研究

李小玲　金方　陳玉如　牟麗麗　劉濤華　呂倩　康穎倩（．貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽550004；．貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗科，貴陽550004）

·論著·

近平滑念珠菌形態(tài)多樣性及毒力因子的分泌活性研究

李小玲1金方1陳玉如2牟麗麗1劉濤華1呂倩1康穎倩1
（1．貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽550004；2．貴陽市第五人民醫(yī)院檢驗科，貴陽550004）

目的比較近平滑念珠菌不同臨床分離株的菌落和細(xì)胞形態(tài)及其分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）酶活性，闡明該病原真菌的形態(tài)多樣性及毒力差異。方法分別用Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose、Spider 3種培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)7株近平滑念珠菌臨床分離株，觀察各菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)；用牛血清白蛋白培養(yǎng)基（BSA）于30℃培養(yǎng)7株近平滑念珠菌，通過觀察形成暈圈能力的強(qiáng)弱確定其毒力因子（SAP）的分泌活性。結(jié)果7株近平滑念珠菌臨床分離株在不同條件下菌落表型有較明顯的不同，菌落有光滑型、皺褶型及火山口樣型，且染色程度不同，各分離株細(xì)胞在形成酵母相或菌絲相的能力方面呈現(xiàn)出不同程度的差異；SAP酶活性觀察實驗中檢測到各菌株水解暈圈大小從2．55 cm到1．55 cm各不相等。結(jié)論近平滑念珠菌臨床分離株具有形態(tài)多樣性，各菌株SAP酶活性明顯不同，提示菌株間的毒力有明顯差異。

近平滑念珠菌；形態(tài)多樣性；SAP酶活性

［Chin J Mycol，2015，10（2）：65?69］

真菌感染的全球流行病學(xué)正在發(fā)生變化［1］。如今，引起嚴(yán)重感染的條件致病真菌逐年增加，但在全球范圍內(nèi)最重要的條件致病真菌仍是念珠菌屬［2?3］。近年來，國外流行病學(xué)調(diào)查研究表明，白念珠菌（Candida albicans）在臨床的分離率有所下降，而非白念珠菌如近平滑念珠菌（Candida parap?silosis）、熱帶念珠菌（Candida tropicalis）和光滑念珠菌（Candida glabrata）等的比例正在升高［2?5］。近平滑念珠菌是一種定植在人體皮膚的條件致病菌［6］，常引起醫(yī)院內(nèi)爆發(fā)性感染［7?8］。由近平滑念珠菌引起的全身感染在世界范圍內(nèi)也顯示出較高的發(fā)病率，被認(rèn)定為是許多國家的第2位最常見的念珠菌［6］。

白念珠菌的致病能力與其形態(tài)多樣性和毒力因子密切相關(guān)。白念珠菌的致病能力與其形態(tài)多樣性和毒力因子密切相關(guān)，如表型轉(zhuǎn)換、黏附素、水解酶的分泌等［1，3，9］。為探究近平滑念珠菌的致病特性，我們對分離自北京大學(xué)第三醫(yī)院、北京朝陽醫(yī)院等醫(yī)院的19株近平滑念珠菌臨床分離株的形態(tài)及毒力因子進(jìn)行了觀察研究。在我們常用實驗條件下，觀察到其中7株臨床分離株有較典型的形態(tài)，且其分泌型天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartic proteinase，SAP）酶活性呈現(xiàn)出不同的特點。

1　材料與方法

1．1材料

近平滑念珠菌臨床分離株7株近平滑念珠菌臨床分離株（菌株來自北京大學(xué)第三醫(yī)院等，已經(jīng)過ITS序列分析明確均為近平滑念珠菌）：JX1051、JX1052、JX1058、JX1060、JX1061、JX1063、JX1064。

培養(yǎng)基Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose兩種培養(yǎng)基根據(jù)參考文獻(xiàn)配制［10?12］（Sigma，美國），配制完成后調(diào)pH值為6．8，110℃15min高壓滅菌，待溫度降至50～60℃左右時，加入熒光桃紅B（phloxin B，5 μg／mL，Sigma，美國），混勻后倒板。Spider培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（Becton，Dicknson and Company，美國）1%，甘露醇（Amresco，美國）1%，磷酸氫二鉀（Sigma，美國）0．2%，溶于雙蒸水并補(bǔ)足容積后調(diào)pH值為7．2，瓊脂（Becton，Dicknson and Company，美國）2%，110℃15min高壓滅菌。牛血清白蛋白培養(yǎng)基（BSA）［6］：酵母碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Becton，Dicknson and Company，美國）1．17%，酵母提取物（Becton，Dicknson and Company，美國）0．01%，牛血清白蛋白（BSA）（MP Blommedicals New Zealand Limited，新西蘭）0．2%，瓊脂（Becton，Dicknson and Company，美國）2%，將前3種成分溶于35mL雙蒸水中，溶化混勻后過濾除菌，將瓊脂加入165mL雙蒸水中，110℃15min高壓滅菌，待瓊脂溫度降至50～60℃左右時，加入過濾除菌液體，混勻后倒板。

實驗儀器與裝置電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），生物顯微鏡（B203LED，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司），血細(xì)胞計數(shù)板（0．10mm，1／400 mm2），體式顯微鏡（M125，萊卡），正置熒光顯微鏡（Axio Imager A2，德國zeiss）。

1．2方法

近平滑念珠菌形態(tài)多樣性觀察活化7株近平滑念珠菌臨床分離株，挑取適量大小的單菌落懸于1mL左右無菌雙蒸水中，混勻后用血細(xì)胞計數(shù)板在生物顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)量將菌液稀釋為1×103CFU／mL，再分別取60μL菌液于Lee’s Glc?NAc、Lee’s glucose、Spider平板上均勻涂板，使每板約50～60個細(xì)胞，以便觀察形態(tài)。后置于37℃培養(yǎng)4d。觀察各分離株菌落及細(xì)胞形態(tài)并分別用體式顯微鏡及正置熒光顯微鏡拍照。每株菌每種條件設(shè)兩個平行。

SAP酶活性觀察［13］分別取適量菌體懸于300μL左右無菌雙蒸水中，菌液濃度應(yīng)足夠大，混勻后菌液顏色呈乳白色為宜。取10μL菌液稀釋100倍后用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，并根據(jù)計數(shù)量推算出原液濃度。將原液稀釋為2×108CFU／mL后，取10μL點到BSA平板上，則所點菌液最終含2×106個細(xì)胞。后置于30℃培養(yǎng)4 d，并觀察菌體周圍暈圈大小。每株菌每種條件設(shè)兩個平行。

2　結(jié)　果

2．1近平滑念珠菌形態(tài)多樣性觀察

如圖1可見在3種培養(yǎng)基中，7株近平滑念珠菌菌落形態(tài)有較明顯的差異。除菌落直徑不等外，在Lee’s GlcNAc培養(yǎng)基中：JX1051、JX1052、JX1060、JX1063、JX1064五株菌落呈光滑的圓形菌落，其中JX1052、JX1064染色不明顯，而JX1051、JX1060、JX1063稍有染色；JX1058、JX1061菌落不圓潤且邊緣稍不規(guī)則，染色較深。在Lee’s glucose培養(yǎng)基中各菌形態(tài)明顯不一致：JX1051、JX1060二者相似，稍有染色的圓形菌落；JX1052菌落光滑圓形染色不明顯；JX1058、JX1061染色較深，JX1058菌落皺縮類似火山口，JX1061菌落頂端突起；JX1063差異最明顯，菌落褶皺如玫瑰花且染色最深；JX1064如JX1061頂端有突起但無染色。在Spider中：JX1051、JX1052呈光滑的圓形菌落，JX1052菌落較平坦；JX1058、JX1060、JX1061、JX1063相似，菌落突出培養(yǎng)基表面較高；JX1064菌落邊緣不規(guī)則。

如圖2可見，7株近平滑念珠菌細(xì)胞形態(tài)也存在差異。在Lee’s GlcNAc培養(yǎng)基中，各株菌細(xì)胞多為酵母型，但在JX1051、JX1058、JX1061、JX1063中有少量菌絲生長，JX1060細(xì)胞較另六株細(xì)長。在Lee’s glucose培養(yǎng)基中各分離株細(xì)胞形態(tài)也明顯不一致：JX1051、JX1058、JX1061、JX1063有菌絲形成，其中JX1063菌絲量最多，其次為JX1061，JX1058細(xì)胞伸長且有菌絲，JX1051菌絲量少，多為酵母型；JX1052及JX1064僅有酵母型細(xì)胞，但JX1064細(xì)胞較寬大；JX1060有部分細(xì)胞伸長，程度較JX1058輕。在Spider培養(yǎng)基中，除JX1063有菌絲生長外，其余菌株均為酵母相，但形態(tài)各異，如JX1051、JX1052有較多圓形酵母細(xì)胞，JX1058中有表面圓滑且較大的橢圓形細(xì)胞，JX1060中有伸長細(xì)胞。

2．2SAP分泌活性觀察

如圖3所示，培養(yǎng)4 d后觀察，各菌菌斑大小相似，且均已出現(xiàn)明顯暈圈，實驗數(shù)據(jù)已記錄至表1（數(shù)據(jù)為兩平行實驗平均值）。如圖3、表1所示，各菌株SAP酶活性實驗暈圈直徑有區(qū)別，由大至小排列依次為：JX1063（約2．55 cm）、JX1064（約2．25 cm）、JX1061（約2．1 cm）、JX1052（約1．95 cm）、JX1060（約1．88 cm）、JX1051（約1．68 cm）、JX1058（約1．55 cm）。

表1　7株近平滑念珠菌臨床分離株SAP酶活性暈圈直徑觀察Tab．1　The SAP enzyme activity of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis

3　討　論

隨著HIV感染的蔓延、免疫抑制劑的廣泛使用、免疫功能低下患者的增加、老齡人口的增多、器官移植等醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，侵襲性真菌感染的發(fā)病率逐漸升高［3］。自20世紀(jì)70年代后期以來，真菌感染日漸成為人類發(fā)病和死亡的重要原因［1］。盡管白念珠菌仍是引起念珠菌病的最主要原因，但近平滑念珠菌感染頻率在逐步上升［2，14?15］，約占念珠菌感染的20%，特別是在小于1歲的嬰幼兒當(dāng)中［16?17］。而在歐洲、亞洲和南美洲的一些醫(yī)院，近平滑念珠菌的血培養(yǎng)分離率甚至高于白念珠菌［18］。全球近平滑念珠菌感染增多及其較高的致死率逐漸引起人們的重視，加大對該菌致病機(jī)理研究以應(yīng)對這一全球性的威脅是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要任務(wù)。

Laffey等［19］的研究提出了近平滑念珠菌在YPD培養(yǎng)基上的4個穩(wěn)定遺傳表型：皺褶型、同心圓型，光滑型及火山口樣型，并探討了各個菌落表型與酵母或假菌絲生長的關(guān)系。我們用Lee’s Gl?cNAc，Lee’s glucose，Spider 3種培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)7株近平滑念珠菌臨床分離株。在Lee’s GlcNAc及Lee’s glucose培養(yǎng)基中，分別由N?乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和葡萄糖（glucose）提供碳源，GlcNAc是主要由胃腸道細(xì)菌產(chǎn)生的一種單糖［20］，而glucose是實驗室培養(yǎng)基常用的碳源；Spider培養(yǎng)基是一種促進(jìn)菌絲生長的培養(yǎng)基。不同培養(yǎng)條件下，7株臨床分離株菌落有光滑型、皺褶型及火山口樣型的差異，且染色程度不同；細(xì)胞有酵母型及菌絲型，在某些條件下還有細(xì)胞伸長的情況。一般來說，在Lee’s GlcNAc、Lee’s glucose培養(yǎng)基中，當(dāng)菌落被染色或出現(xiàn)皺縮時，常會有菌絲生長或出現(xiàn)細(xì)胞伸長情況，在Lee’s glucose培養(yǎng)基更為明顯。最突出的是JX1063，其在Lee’s glucose中菌落褶皺如玫瑰花且染色最深，菌絲大量生長；而當(dāng)菌落光滑無染色時，細(xì)胞常為酵母型，如JX1052。相對于酵母形態(tài)，菌絲形態(tài)細(xì)胞對宿主有著更強(qiáng)的侵襲性。由圖1、2也可知，相比其他培養(yǎng)基，Lee’s glucose中各菌形態(tài)差別最大，且更易促進(jìn)菌絲生長。實驗所用三種培養(yǎng)基成份不同，不同培養(yǎng)條件下各分離株菌落及細(xì)胞形態(tài)也存在差異。而宿主體內(nèi)環(huán)境情況多樣，因此該實驗結(jié)果暗示在不同生理條件下近平滑念珠菌的形態(tài)也存在多樣性。形態(tài)多樣性往往也提示菌株的其他生物特性可能不同［19］，如當(dāng)細(xì)胞處于酵母形態(tài)或菌絲形態(tài)時，其致病性及生物膜形成能力等方面存在著差異。

圖1　7株近平滑念珠菌臨床分離株在三種培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)　圖2　7株近平滑念珠菌臨床分離株在三種培養(yǎng)基中的細(xì)胞形態(tài)　圖3 7株近平滑念珠菌臨床分離株SAP酶活性觀察Fig．1　The colony morphology of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis on three kinds of media　Fig．2　The cell morphology of 7 clinical isolates of Candida parapsilosis on three kinds of culture media　Fig．3　The SAP enzyme activity test of 7clinical isolates of Candida parapsilosis

已有研究證明編碼分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）的基因存在于大多數(shù)致病性念珠菌當(dāng)中，包括白念珠菌（Candida albicans），近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis），都柏林念珠菌（Candida dubliniensis）和熱帶念珠菌（Candida tropicalis）［1］。天冬氨酸蛋白酶（Sap1p到Sap10p）的分泌是白念珠菌的一個重要致病因素［18，21］，它通過破壞宿主黏膜和降解重要的免疫性結(jié)構(gòu)防御蛋白來促進(jìn)致病菌侵襲并定植于宿主組織［1，18］，近平滑念珠菌SAP酶活性較白念珠菌低［18，22］。Silva等［23］證明近平滑念珠菌對口腔上皮的侵入性不佳，但其仍可誘發(fā)顯著損害，這即與特定的SAP基因表達(dá)有關(guān)。牛血清白蛋白培養(yǎng)基中含有天冬氨酸，根據(jù)之前的研究［13］，當(dāng)近平滑念珠菌分泌天冬氨酸蛋白酶時，會水解天冬氨酸在固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)暈圈，暈圈大小提示SAP分泌活性的強(qiáng)弱。觀察結(jié)果可推知不同菌株之間SAP酶活性存在強(qiáng)弱的差別，JX1063 SAP酶活性最強(qiáng)，JX1064其次，JX1058最弱。結(jié)合菌落及細(xì)胞形態(tài)分析，JX1063及JX1058在各個培養(yǎng)基中均有菌絲生長，而JX1064及JX1052在各培養(yǎng)基中均呈酵母形態(tài)，由此可知不同菌株在菌絲形成能力和SAP分泌能力兩者間并不存在相關(guān)性。7株臨床分離株SAP分泌活性各不相同，提示其毒力也有差異，SAP參與的發(fā)病機(jī)制及在其中所起作用尚不清楚［18，24］，但SAP抑制劑已被測試為抗真菌藥物［18］。抑肽素A是一種特定的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷白念珠菌和近平滑念珠菌通過黏膜表面的初始滲透，并減輕實驗皮膚念珠菌病的組織病理學(xué)改變［25?26］。因此，對毒力因子活性的進(jìn)一步研究也有著重要意義。

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［本文編輯］衛(wèi)鳳蓮

The morphological diversity and virulence factorssecretory activity of Candida parapsilosis

LI Xiao?ling1，JIN Fang1，CHEN Yu?ru2，MU Li?li1，LIU Tao?hua1，LV Qian1，KANG Ying?qian1
（1．Department of Microbiology，Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China；2．Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)ifth People＇s Hospital of Guiyang City，Guiyang 550004，China）

ObjectiveCompared the colonies and cells morphology and the secreted aspartic proteinase（SAP）enzyme activity of different clinical isolates of Candida parapsilosis，and elucidated the morphological diversity and the differences of virulence of the pathogenic fungi．MethodSeven clinical isolates of Candida parapsilosis were cultured respectively on different solid media，and the morphology characteristics of colonies and cells were observed and recorded．Strains were also cultured on solid medium of bovine ser?um albumin（BSA）at 30℃for determining the secretory activity of the virulence factors（SAP）by observing the proteolytic halos．ResultDiverse colonies and phenotypes of the above strains were checked under several sorts of conditions—smooth，crepe and cra?ter in various shades of stained color，and the ability of filamentation were also different from each other among the tested strains．In addition，the sizes of proteolytic halos were various from 2．55 cm to 1．55 cm．ConclusionThere are diverse phenotypes which can be shown for the clinical isolates of Candida parapsilosis，and the SAP enzyme activities of them are distinct，which may imply the signifi?cant virulent differences among the strains．

Candida parapsilosis；Morphological diversity；SAP activity

R 379．4

A

1673?3827（2015）10?0065?05

國家自然基金（31060006，31260029）；貴陽市科技局社會發(fā)展與民生計劃（筑科合同［2011103］16號），貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目（黔科合SY字［2011］3017號），貴陽市科技局科技創(chuàng)新平臺計劃（筑科合同2012303號）

李小玲，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：wangyiideyx＠163．com

康穎倩，E?mail：joycekangtokyo＠qq．com

2015?01?12