左西孟旦對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

劉永利 張基昌 潘洪濤 王旭渤 劉寧 史永峰 李楊雪 劉斌

基礎(chǔ)研究

左西孟旦對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用

劉永利 張基昌 潘洪濤 王旭渤 劉寧 史永峰 李楊雪 劉斌

目的 研究左西孟旦對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用。方法 ①MTT法檢測不同濃度的左西孟旦及H2O2對大鼠心肌細胞生存率的影響。②光鏡觀察左西孟旦及H2O2對大鼠心肌細胞形態(tài)學的影響。③流式細胞儀檢測左西孟旦及H2O2對大鼠心肌細胞凋亡的影響。結(jié)果 MTT顯示：①濃度為0.03～0.24μmol/L的左西孟旦加入正常大鼠心肌細胞后，測得其吸光度值與空白對照組吸光度值接近，并沒有促進增殖的作用；②當加入濃度＞0.3μmol/L的左西孟旦后，測得細胞吸光度值明顯低于空白對照組；③H2O2500μmol/L和1000μmol/L處理大鼠心肌細胞，吸光度值明顯低于空白對照組；④預先加入左西孟旦進行預處理的心肌細胞吸光度較單加入H2O2的吸光度值明顯升高且與濃度呈正相關(guān)。光鏡下觀察：①單純加入左西孟旦組的心機細胞呈現(xiàn)梭形，呈放射狀或柵欄狀排列，濃度增加，未見細胞偽足收縮及胞體變圓。②加入H2O2500μmol/L和1000μmol/L后，隨H2O2濃度的增加，胞體變圓，偽足收縮的細胞增多。③有左西孟旦保護的心肌細胞，胞體變圓，偽足收縮的細胞數(shù)量與濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，左西孟旦濃度越高，胞體變圓，偽足收縮的細胞越少。流式細胞結(jié)果顯示：①空白對照組早期凋亡為0.31%，晚期凋亡6.88%，壞死的心肌細胞4.65%，存活的心肌細胞88.16%。②H2O21000μmol/L組早期凋亡為1.52%，晚期凋亡8.03%，壞死的心肌細胞7.66%，存活的心肌細胞82.79%。③Levo 0.24μmol/L+H2O21000μmol/L組早期凋亡為0.44%，晚期凋亡6.48%，壞死的心肌細胞4.95%，存活的心肌細胞88.13%。結(jié)論 左西孟旦對大鼠心肌細胞氧化損傷有保護作用，且0.24μmol/L組作用較0.03μmol/L組作用更明顯。

左西孟旦；心力衰竭；氧化應(yīng)激；凋亡

心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的最后階段，隨著對心血管疾病治療方法研究的進展和人口壽命的延長，心力衰竭的發(fā)生率逐年增加。Framingham研究[1]表明，冠心病、高血壓、糖尿病增高健康人群心血管疾病的發(fā)病率和死亡率[2]，是引起心衰的主要原因。心肌細胞的凋亡、氧化應(yīng)激損傷是心力衰竭重要的病理生理基礎(chǔ)。

作為治療心力衰竭的新型藥，左西孟旦（Levosimendan，Levo）兼有鈣離子增敏（為主）、血管擴張及磷酸二酯酶抑制等作用，不是通過增加心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度來增加心肌收縮力[3,4]，而是增加對鈣離子的敏感性，進而增加心肌的收縮力。與傳統(tǒng)的鈣離子增敏劑的作用方式不同，其鈣離子增敏作用是鈣依賴性的，即在收縮期因細胞內(nèi)鈣濃度暫時升高而作用最強，舒張期的作用較弱，因此不會降低心臟的舒張功能，能很好地改善心功能[5]。與慢性心功能不全和急性充血性心力衰竭治療所應(yīng)用的傳統(tǒng)正性肌力藥相比，在減少心肌梗死面積、減少心律失常的發(fā)生率、增加心輸出量、改善左心室功能等方面顯示了明顯的優(yōu)越性[6]。

本實驗從心肌細胞氧化應(yīng)激入手，應(yīng)用體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞，以高濃度H2O2（500μmol/L和1000μmol/L）對培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行處理，模擬心肌細胞缺血、缺氧狀態(tài)，觀察左西孟旦抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗選擇和分組 左西孟旦每支12.5 mg/5 ml，相對分子質(zhì)量為280.29 g/mol。我們將左西孟旦的藥物濃度配制成 0.03、0.06、0.12、0.24，0.30、0.36、0.48、0.96、1.98 μmol/L 9組，加上空白對照組一共10組。

1.1.2 主要實驗器材和試劑 流式細胞儀、振蕩器、37℃5%CO2孵箱購自美國Thermo公司，胎牛血清、PBS、MTT、二甲亞風（DMSO）、H2O2、凋亡試劑盒購自北京化工廠，胰酶、不含EDTA的胰酶消化液購自上海試劑有限公司，左西孟旦（Levo）由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法 將鋪好的96孔板置于鏡下觀察，并放置于孵箱中，在37℃5%CO2孵箱中孵化12 h。

12 h后，取出96孔板，在光鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞呈梭形生長，貼附于培養(yǎng)皿的底部，核為卵圓形，位于胞質(zhì)的中央。

抽出96孔板內(nèi)原有細胞培養(yǎng)液，加入上述9組不同濃度的藥品，每個濃度重復6次。同時設(shè)置6個空白對照組，共10組，將96孔板再次放入37℃ 5%CO2孵箱中，孵24 h后再次在光鏡下觀察細胞形態(tài)。

將不同濃度的左西孟旦加入正常H9C2大鼠心肌細胞進行MTT檢測，觀察其對心肌細胞是否有促增值作用。

將不同濃度的左西孟旦加入H9C2大鼠心肌細胞培養(yǎng)液中進行預防處理15 min，同時設(shè)立空白對照組，應(yīng)用實驗中心已成熟的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型，對處理過的心肌細胞及未加入左西孟旦進行預處理的心肌細胞進行H2O2氧化應(yīng)激處理，光鏡下觀察細胞的狀態(tài)，并行MTT及流式細胞檢測，觀察左西孟旦對H2O2所致大鼠心肌細胞氧化損傷是否有保護作用。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件分析。計量資料以±s表示，偏態(tài)分別轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布后再進行分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度左西孟旦對大鼠心肌細胞存活率的影響 酶聯(lián)免疫檢測儀中，在570 nm波長處測定其吸光度（OD）值。每個樣本6個重復孔，去掉一個最高值和一個最低值，用SPSS 20.0軟件分析，結(jié)果見表1。

表1 不同濃度左西孟旦作用于大鼠心肌細胞后的吸光度（OD）值及標注差

不同濃度的左西孟旦（0.03～1.98μmol/L）作用大鼠心肌細胞24 h后，測得吸光度值，如圖1所示：①濃度為0.03～0.24μmol/L的左西孟旦加入正常大鼠心肌細胞后，測得其吸光度值與空白對照組吸光度值接近，并沒有促進增殖的作用；②當加入濃度＞0.3μmol/L的左西孟旦后，測得細胞吸光度值明顯低于空白對照組（P＜0.05），表明當左西孟旦濃度＞0.3μmol/L時對細胞具有損傷作用，因此選取左西孟旦保護過氧化氫所致的心肌細胞損傷的濃度，要＜0.3 μmol/L。

2.2 左西孟旦對大鼠心肌細胞的影響 在光鏡下觀察：單純加入左西孟旦組的心機細胞呈梭形，放射狀或柵欄狀排列，濃度增加，未見細胞偽足收縮及胞體變圓。避光條件下單獨加入H2O2500μmol/L和1000μmol/L，2 h后觀察細胞，隨H2O2濃度的增加，胞體變圓，偽足收縮的細胞增多。在左西孟旦保護下加入H2O2，可見胞體變圓、偽足收縮的細胞逐漸減少，且與左西孟旦濃度呈正相關(guān)，左西孟旦濃度越高，胞體變圓、偽足收縮的細胞越少。見圖2。

2.3 左西孟旦與H2O2共同作用對細胞存活率的影響 酶聯(lián)免疫檢測儀中，在570 nm波長處測定其吸光度（OD）值。每個樣本6個重復孔，去掉一個最高值和一個最低值，用SPSS 20.0軟件分析，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度左西孟旦對抗不同濃度的H2O2所致大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激損傷后的吸光度（OD）值及標準差

加入左西孟旦組的心肌細胞與對照組相比，吸光度值未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），加入H2O2后測得H2O2500μmol/L和1000μmol/L組吸光度的值明顯低于空白對照組，而預先加入左西孟旦進行預處理的心肌細胞的吸光度較單加入H2O2的吸光度值明顯升高且與濃度呈正相關(guān)（P＜0.05）。見圖3。

2.4 左西孟旦及H2O2對大鼠心肌細胞凋亡的影響 經(jīng)流式細胞儀檢測，如圖4A所示，正常細胞組早期凋亡為0.31%，晚期凋亡6.88%，壞死的心肌細胞4.65%，存活的心肌細胞88.16%。單純加入過氧化氫組與對照組相比，凋亡率明顯增加，如圖4B所示，早期凋亡為1.52%，晚期凋亡8.03%，壞死的心肌細胞7.66%，存活的心肌細胞82.79%。而用左西孟旦預處理心肌細胞后加入過氧化氫，與單純加入過氧化氫組相比，細胞凋亡率明顯降低，圖4C所示，早期凋亡為0.44%，晚期凋亡6.48%，壞死的心肌細胞4.95%，存活的心肌細胞88.13%。

3 討論

心衰的病理生理改變十分復雜，人們對其不斷深入研究，20世紀40年代認為是體液潴留機制，60年代認為是泵功能障礙（血流動力學障礙）機制，而80年代認為后神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子系統(tǒng)的過度激活機制得到重視[7]。

對來自心力衰竭患者心肌標本的研究也證實，心肌凋亡指數(shù)（apoptosis index）高達 35.5%（發(fā)生凋亡的細胞核數(shù)/每100個細胞核），而對照僅為0.2%～0.4%[8]。氧化應(yīng)激、心臟負荷增加、細胞因子、缺血缺氧、神經(jīng)-內(nèi)分泌失調(diào)等都可誘導心肌細胞凋亡。在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中，由于氧自由基生成過多和（或）抗氧化能力下降導致氧化應(yīng)激的發(fā)生、DNA和線粒體的損傷及促凋亡信號激酶的激活，引起心肌細胞凋亡[9]。

心力衰竭藥物治療的基本原則是強心、利尿和擴血管。臨床上常用具正性肌力作用的藥物進行治療，其中包括強心甙類、利尿劑、β受體阻斷劑和部分激動劑、擴血管藥和血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）等。近幾年，鈣增敏劑的研究與開發(fā)已成為一熱門課題，為心衰的治療提供了新的途徑[10]，并取得良好的臨床效果。

左西孟旦與心臟肌鈣蛋白（心臟肌原纖維細絲）結(jié)合可以增強心臟肌鈣蛋白C對鈣離子的敏感性。本品還具有獨特的雙重作用模式，能增加心臟輸出并使靜脈、動脈和腦血管擴張，降低前負荷和后負荷，改善冠脈血流。

本實驗從心肌細胞氧化應(yīng)激入手，應(yīng)用體外培養(yǎng)大鼠心肌細胞，能夠代表心肌結(jié)構(gòu)和功能的最基本單位，可以排除體內(nèi)神經(jīng)及液體因素的干擾，易于量化心肌細胞的改變，給予外源性H2O2作用于心肌細胞，類似于許多心血管疾病中在體心肌細胞所面臨的H2O2爆發(fā)，以高濃度H2O2（500μmol/L和1000μmol/L）對培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行氧化損傷，以觀察Levo抗氧化損傷的作用。

將左西孟旦分為0.03～1.98μmol/L共9組藥物濃度，加入心肌細胞內(nèi)，觀察其對細胞的安全濃度。經(jīng)MTT檢測后，左西孟旦對正常大鼠心肌細胞無促增殖作用，與空白對照組相比，左西孟旦濃度＞0.3μmol/L組吸光度值明顯降低（P＜0.05），表明當左西孟旦濃度＞0.3μmol/L的時候?qū)毎哂袚p傷作用，因此選取左西孟旦保護過氧化氫所致的心肌細胞損傷的濃度要＜0.3μmol/L。

光鏡下顯示，加入H2O2500、1000μmol/L，細胞形態(tài)有改變，胞體變圓，偽足收縮。當加入左西孟旦保護后再加入H2O2，可見胞體變圓、偽足收縮的細胞逐漸減少，且與左西孟旦濃度呈相關(guān)性，左西孟旦濃度越高，胞體變圓、偽足收縮的細胞越少。因此可初步認為左西孟旦有對抗H2O2所致氧化應(yīng)激損傷的作用。

為進一步證實左西孟旦的抗氧化應(yīng)激損傷，對光鏡下觀察到的細胞進行MTT檢測。結(jié)果顯示，加入左西孟旦組的心肌細胞與對照組相比，吸光度值無明顯差異（P＞0.05），加入 H2O2后測得 H2O2500、1000μmol/L組吸光度的值明顯低于空白對照組，而預先加入左西孟旦進行預處理的心肌細胞的吸光度較單加入H2O2的吸光度值明顯升高且與濃度呈正相關(guān)（P＜0.05）。

流式細胞儀的結(jié)果進一步證實，單純加入過氧化氫組與對照組相比，凋亡率明顯增加，而用左西孟旦預處理心肌細胞后加入過氧化氫，與單純加入過氧化氫組相比，細胞凋亡率明顯降低，說明左西孟旦有對抗H2O2所致氧化應(yīng)激損傷的作用。

當組織細胞缺血、缺氧時，氧自由基大量生成、堆積，預處理期mito KATP通道開放可激活蛋白激酶C，線粒體生成ROS而啟動心肌保護作用，再灌注mito KATP通道開放又能抑制ROS的爆發(fā)，減少ROS對細胞的不可逆損傷，因此mito KATP通道開放既能增加ROS的生成也能減少ROS的爆發(fā)。有報道顯示，左西孟旦抑制細胞凋亡的作用主要是與開放mito KATP有關(guān)[11]。心肌細胞和血管mito KATP通道開放，打開能源和宿神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，可逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)鈣超載，增加細胞內(nèi)的供血供氧，緩解心肌細胞凋亡、心肌重塑和心肌發(fā)炎[12,13]。

心肌缺血再灌注損傷的細胞死亡形式包括凋亡和壞死?；铙w和離體動物實驗均顯示，心肌缺血再灌注過程既可引起心肌細胞壞死，也可誘導心肌細胞凋亡。研究表明，凋亡細胞隨缺血或再灌注時間延長而顯著增多，提示心肌缺血或再灌注過程有促進或加速心肌細胞凋亡的作用[14]。線粒體內(nèi)鈣超載導致線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能改變是誘發(fā)心肌細胞凋亡的一個關(guān)鍵因素[15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌凋亡在缺血性心臟病、缺血再灌注損傷、心力衰竭等疾病過程中發(fā)揮十分重要的作用。

由于以上原因故可防止或減輕Ca2+增敏導致的舒張功能損害及細胞內(nèi)鈣超載，從而對缺血-再灌注細胞可起到良好的保護作用。同時左西孟旦開放mito KATP通道，使K+內(nèi)流進入線粒體，降低了內(nèi)膜電位差，使線粒體膜發(fā)生了去極化，降低了線粒體外Ca2+內(nèi)流的驅(qū)動力，從而減輕線粒體鈣超載，使細胞膜超級化，平滑肌舒張，從而擴張冠脈，增加心肌供血，對心肌產(chǎn)生保護作用[16]。左西孟旦對離體心臟Langendorff模型缺血-再灌注損傷保護作用已得到證實，左西孟旦作為抗心力衰竭藥物在臨床上已取得明顯效果，但是否可將其應(yīng)用于缺血性心臟病的治療，仍需進一步的大規(guī)模臨床試驗去驗證。

圖1 MTT檢測不同濃度左西孟旦作用于大鼠心肌細胞后的生存率比值

圖2 光鏡觀察左西孟旦對大鼠心肌細胞的影響

圖3 MTT檢測不同濃度左西孟旦對抗不同濃度的H2O2所致大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激損傷后的生存率比值

圖4 流式細胞儀檢測左西孟旦及H2O2對大鼠心肌細胞凋亡的影響

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Protective effects of Levosimendan on oxidative damage in cardiomyocutes

LIU Yong-li＊，ZHANG Ji-chang，PAN Hong-tao，et al.＊Department of Cardiology， the Fourth Hospital of Jilin University，Changchun 130000，China

LIU Bin，E-mail：liubin3333@vip.sina.com

Objective To study whether there is protective effect of Levosimendan against oxidative damage in cardiomyocytes.Methods ⑴The different survival rates of rat cardiomyocytes corresponding different concentrations of Levosimendan were studied by MTT.⑵Observe rat cardiomyocytes morphology when treated by Levosimendan and H2O2with light microscope.⑶The rat cardiomyocytes apoptosis rate was examined by Flow cytometer technology when treated with Levosimendan and H2O2.Results Results of MTT：⑴Normal rat myocardial cells were treated by different concentrations of Levosimendan from 0.03-0.24μmol/L.The result of MTT showed that there is no significant difference between the treated group and normal control group.⑵When treated by Levosimendan which concentration was higher than 0.3μmol/L the optical density was much lower than that of normal controls.⑶The optical density fell obviously after treated by H2O2.⑷The optical density of the group which pretreated by Levosimendan did not fall as obviously as that was without pretreating.The optical density changedwith the concentration of Levosimendan.The cell morphology were observed by light microscope：⑴The rat cardiomyocytes which were treated by Levosimendan only showed fusiform cells，radial or fence-like arrangement.Morphology of rat cardiomyocytes did not change with different concentrations of Levosimendan.⑵The number of rounded cell bodies of the group treated by H2O2which concentration was 1000μmol/L were much more that was 500 μmol/L.⑶The Levosimendan could protect cardiomyocytes from H2O2，there were more rounded cell bodies than control group with higher concentration of Levosimendan，the higher the concentration of Levosimendan，the less shrinkage of cell pseudopods.Results of Flow cytometer：⑴The control group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 0.31%，6.88%，4.65%and 88.16%respectively.⑵The H2O21000 μmol/L group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 1.52%，8.03%，7.66%and 82.79%respectively.⑶The Levo 0.24μmol/L+H2O21000μmol/L group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 0.44%，6.48%，4.95%and 88.13%respectively.Conclusion Levosimendan has protective effects against oxidative damage in cardiomyocytes.The protective effect is much more obvious when the concentration of Levosimendan is 0.24μmol/L than that of 0.03μmol/L.

Levosimendan；Heart failure；Oxidative Stress；Apoptosis

吉林省直醫(yī)學專項資助項目［項目編號：（2014）科技字（520）號］

130000 吉林省長春市，吉林大學第四醫(yī)院心內(nèi)科（劉永利、潘洪濤、王旭渤）；

吉林大學第二醫(yī)院心內(nèi)科（張基昌、劉寧、史永峰、李楊雪、劉斌）

劉斌，E-mail：liubin3333＠vip.sina.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.11.018

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）11-1033-05

2015-08-24）