WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因組水平研究現(xiàn)狀

顏君 郭興啟 曹學(xué)成

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，能夠調(diào)控植物的生長和發(fā)育進(jìn)程及生物和非生物脅迫。植物基因組測序的大規(guī)模完成，為在基因組水平全面研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族提供了可能。2003年，72個擬南芥AtWRKY從測序基因組數(shù)據(jù)中鑒定出，并且發(fā)現(xiàn)49個參與了病菌防御過程。之后，實時定量PCR（qRT-PCR）、微陣列芯片（Microarray）、RNA測序（RNA-seq）等技術(shù)應(yīng)用到大規(guī)模分析植物WRKY家族的研究中。尤其是2013年后，全基因組鑒定植物WRKY基因家族的研究報道日益增多。本文綜述了近年來全基因組鑒定植物WRKY基因家族和其功能的研究成果，旨在為研究人員提供一定的參考。

1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)、功能及起源

1.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)

1994年，Ishiguro［1］首次從甘薯中克隆出一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子并命名為SPF1，之后人們相繼克隆出WRKY家族的其他成員并研究了它們的特性和功能，主要集中在擬南芥、煙草、大豆和辣椒中［2］。

WRKY基因家族的成員都含有WRKY結(jié)構(gòu)域，其蛋白質(zhì)序列N端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和CX4-5CXnHXH/C（X為任意氨基酸），屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的W-box［（T）TGACC（A/T）］核苷酸序列而調(diào)控基因表達(dá)［3］。根據(jù)WRKY的結(jié)構(gòu)和特點，可分為3個組（圖1），其中組Ⅰ含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，而組Ⅱ和組Ⅲ都只含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域［4］。

圖1 擬南芥全長WRKY蛋白的結(jié)構(gòu)圖和家族分類圖［4，5］

1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，是很多信號網(wǎng)絡(luò)不可缺少的一部分，能調(diào)控多種植物進(jìn)程：疾病防御、非生物脅迫應(yīng)答、營養(yǎng)不足、衰老、種子和毛狀體發(fā)育、胚胎發(fā)生、多種發(fā)育方面及植物激素控制的生物進(jìn)程；WRKYs可以以同源二聚體或異源二聚體的形式，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的激活子或抑制子［6］。WRKY調(diào)控涉及到的信號通路，包括脫落酸（Abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）/乙烯（Ethylene，ET）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK）、14-3-3 蛋白、鈣調(diào)蛋白（calmodulin）、組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases）、阻力蛋白（Resistance proteins）等［6，7］。

1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的起源和進(jìn)化

早在 2004年，Ulker［8］就提出組Ⅰ WRKY 基因或許代表著WRKY基因的祖先狀態(tài)。2005年，Zhang等［9］研究了當(dāng)時公布的基因組數(shù)據(jù)（包括擬南芥、水稻、綠藻Chlamydomonas reinhardtii等），提出了一個進(jìn)化模型——WRKY基因起源于原生生物，在綠藻等植物中經(jīng)過多次基因復(fù)制和歧化事件，導(dǎo)致在開花植物中形成一個大的基因家族，例如在水稻中有 100個成員（圖 2）。2005年，Wu等［10］研究了水稻和擬南芥中WRKY基因的起源，發(fā)現(xiàn)水稻組Ⅲ 的基因通過復(fù)制和劇烈的擴(kuò)增產(chǎn)生；在原生生物（Giardia lamblia，Dictyostelium discoideum）和綠藻（Chlamydomonas reinhardtii）中存在WRKY-like的類似祖先的基因。

2 擬南芥和水稻全基因組的WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究

WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)后，其生物學(xué)功能的研究主要依賴于經(jīng)典分子生物學(xué)實驗。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，特別是植物基因組測序的完成，為在基因組水平全面研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族提供了可能。2000年模式植物擬南芥基因組測序完成［11］，2002年水稻基因組測序完成［12］，故全基因組水平WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的研究首先開始于這兩種植物。

2.1 擬南芥全基因組的WRKY研究

2000年，Eulgem［4］通過分析基因組序列，鑒定出61個擬南芥（Arabidopsis thaliana）WRKY基因（AtWRKY1 to AtWRKY61）。2003年，Dong 等［13］又發(fā)現(xiàn)一些新的WRKY基因（共鑒定出72個）；Northern blotting印記法揭示出這72個AtWRKY中有49個有差別地調(diào)節(jié)了抗病進(jìn)程，或被SA處理后的反應(yīng)進(jìn)程。2006年，Tosti等［14］用實時反轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time reverse transcriptase PCR）和微陣列基因芯片（Gene chip microarray）的方法發(fā)現(xiàn)，WRKY介導(dǎo)了O3壓力誘導(dǎo)的RLKs（Receptor-like kinases）信號通路，這一點和病原體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)信號通路相似。2011年，Wang等［15］分析了擬南芥WRKY基因家族的進(jìn)化，建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其分為五個亞組（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb和Ⅲ）；檢查了進(jìn)化動力，發(fā)現(xiàn)凈化選擇（purifying selection）和功能歧化（Functional divergence）在本家族進(jìn)化中存在。

圖2 WRKY基因家族的起源和復(fù)制模式圖［9］

2.2 水稻全基因組的WRKY研究

2005年，Xie等［16］預(yù)測出 81個水稻（Oryza sativa）OsWRKY基因，進(jìn)化分析支持假說“WRKY基因經(jīng)過了一次WRKY結(jié)構(gòu)域的復(fù)制形成祖先狀態(tài)，后又經(jīng)過丟失一個WRKY結(jié)構(gòu)域的過程形成了組Ⅱ和組Ⅲ”；染色體分布分析發(fā)現(xiàn)26％的OsWRKY位于1號染色體；Northern blot研究糊粉細(xì)胞的WRKY基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)OsWRKY-24、-51、-71、 和 -72被 ABA所 誘 導(dǎo)。2006年，Ryu等［17］用半定量 RT-PCR和 Northern blot分析證明一部分的WRKY涉及到了應(yīng)答水稻病原體感染的防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)程：SA處理后，葉片的OsWRKY-45、-62表達(dá)量增高；JA處理后，OsWRKY-10、-82和-85增高；同時兩者處理，OsWRKY-30和-83增高。2008年Ramamoorthy等［18］預(yù)測出103個OsWRKY基因，77.7％位于水稻復(fù)制區(qū)域，45.6％是零碎復(fù)制（Fragmentally duplicated），而35％（包含在45.6％中）是串聯(lián)復(fù)制（Tandem duplicate）；全面轉(zhuǎn)錄譜分析，發(fā)現(xiàn)正常生長組有65個OsWRKY基因在轉(zhuǎn)錄豐度和基因表達(dá)模式有差異，而在非生物脅迫（冷、干旱、高鹽）壓力和植物激素處理下54個在轉(zhuǎn)錄豐度表現(xiàn)出很大的不同。

2009年，Berri等［19］發(fā)現(xiàn) 104個 OsWRKY基因中的24個成員差異性地調(diào)節(jié)至少一種檢測的生長壓力，存在9個OsWRKY基因簇（由系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)基因和不相關(guān)基因組成）顯著地共表達(dá)；用基因微陣列芯片和泊松相關(guān)系數(shù)分析方法發(fā)現(xiàn)AtWRKYs從屬于兩個主要的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（COR-A，COR-B）和兩個小點的網(wǎng)絡(luò)（COR-C，COR-D）。2014年，Nuruzzaman等［20］分析了水稻近等基因系在可控制情況下、激素處理、干旱狀況下的全轉(zhuǎn)錄組概況，發(fā)現(xiàn)存在差異基因活化和組織特異性基因活化。

3 其他植物全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展

隨著植物基因組的大面積測序，其他植物全基因組的WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究也在如火如荼地進(jìn)行。此類研究策略一般如圖3所示，主要分為生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式研究兩部分。

3.1 鑒定和進(jìn)化方面的分析

全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究的基礎(chǔ)是通過BLAST或HMM掃描基因組，鑒定出本植物基因組WRKY基因家族成員的數(shù)量和序列等（表1）；然后基于保守序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而對WRKY家族進(jìn)行分類等其他生物信息學(xué)分析。大部分植物的WRKY基因家族的分類是相似的，可以分為3個組和若干亞組［Ⅰ、Ⅱ（Ⅱa-Ⅱe）、Ⅲ］。

圖3 全基因組鑒定和分析WRKY基因家族的一般研究策略

除了家族分類，其他生物信息學(xué)分析也是基于研究植物WRKY的全基因組鑒定信息，但是各文獻(xiàn)的研究側(cè)重點各不相同，現(xiàn)總結(jié)如下。（1）染色體位置分析：有研究發(fā)現(xiàn)其植物的WRKY在有些染色體位置上富集形成了物種特異性的基因簇，來源于片段復(fù)制（Segmental duplication）或者串聯(lián)復(fù)制（Tandem duplication）［23，27，38-40，45，46］。 巴 豆 與水稻、擬南芥、蓖麻的WRKY基因進(jìn)化分析比較發(fā)現(xiàn)JcWRKY基因沒有發(fā)生基因復(fù)制事件［36］。大部分的二穗短柄草BdWRKY集群基因?qū)Γ–lustered gene pairs）有著高度相似的WRKY結(jié)構(gòu)域，暗示它們或許具有功能冗余［28］。棉花物理圖譜比對發(fā)現(xiàn)GrWRKY和GaWRKY的染色體位置并不相互對應(yīng)，暗示其二倍體化時發(fā)生了劇烈的染色體重排［38］。（2）進(jìn)化動力分析 ：玉米［23］、大豆［46］、棉花［38］進(jìn)化中存在功能歧化現(xiàn)象。中國白菜［32］和棉花［38］經(jīng)歷了進(jìn)化選擇。大豆不同的亞組具有不同的進(jìn)化速率，組Ⅱe和組Ⅲ檢測到很強(qiáng)的正選擇壓力［46］。（3）啟動子分析：歐洲大葉楊很多涉及壓力和防御應(yīng)答的順式作用元件分布在PtWRKY基因的上游［5］。（4）單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析：許多棉花（GrWRKY和GaWRKY）SNP位點不均等的分布在外顯子和內(nèi)含子區(qū)域［38］。（5）構(gòu)建數(shù)據(jù)庫：構(gòu)建了一個包含二穗短柄草BrWRKY和其他植物WRKY等功能的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//www.igece.org/WRKY/BrachyWRKY/BrachyWRKYIndex.html）［27］。（6）功能注釋和標(biāo)簽表達(dá)分析：揭示小麥TaWRKY的主要功能是對刺激物的應(yīng)答和對病菌侵?jǐn)_的防御，分子機(jī)制主要是結(jié)合DNA；在空白對照植物和由葉銹病菌（Puccinia triticina）接種過的小麥近等基因系之間表達(dá)有差異［26］。通過同源分析發(fā)現(xiàn)有些菊花CmWRKY與擬南芥AtWRKY功能相同，有些不一樣［53］。（7）亞細(xì)胞定位預(yù)測：這些假定的小白菜BcWRKY 蛋白富集于細(xì)胞核區(qū)域，BcWRKY-25和-40的實驗更加證實了這一預(yù)測［30］。（8）地質(zhì)年代分析：通過系統(tǒng)進(jìn)化分析7個WRKY基因，鑒定出山葵屬（Syagrus）是椰子屬（Cocos）的一個姐妹群，兩者分歧時間發(fā)生在3 500萬年前，建立發(fā)生在3 700萬年前的漸新世（Oligocene）的東部巴西地區(qū)［54］。

表1 植物中WRKY的鑒定

還有一些鑒定方面的研究。（1）亞細(xì)胞定位：通過綠色熒光蛋白（GFP）觀察了4個歐洲油菜BnWRKY蛋白的細(xì)胞亞定位［29］。GFP觀察了大麥HvWRKY1和2的核定位，功能實驗證明兩者是病菌侵染（BghA6，Blumeria graminis f. sp. hordei Speer isolate A6）誘導(dǎo)基因 HvGER4c 的抑制子［22］。（2）蛋白相互作用：在酵母實驗中觀察到橡膠樹HbWRKY-3、-14、-55蛋白結(jié)合HbSRPP（橡膠小粒子蛋白，Small rubber particle protein）啟動子并激活其表達(dá)，說明HbWRKY可能涉及到自然橡膠的生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［37］。

3.2 表達(dá)模式研究

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族作為重要的基因家族參與應(yīng)答環(huán)境信號、調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程等?；谌蚪M鑒定研究植物WRKY家族成員的信息，通過qRT-PCR、微陣列基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測序等高通量手段全面研究本植物WRKY家族成員在不同試劑處理、不同環(huán)境壓力下的基因表達(dá)模式，為揭示其具體作用機(jī)制提供了一定的線索。

3.2.1 qRT-PCR 主要用qRT-PCR的方法驗證了各植物WRKY家族的差異表達(dá)、參與了生物脅迫和非生物脅迫、涉及到了JA等各信號通路。歐洲油菜13個BnWRKY基因會對病原真菌和激素處理（ABA、JA、SA、ET、細(xì)胞分裂素的一種或多種）反應(yīng)應(yīng)答［29］。黃瓜在正常生長條件下48個CsWRKY在轉(zhuǎn)錄豐度和基因表達(dá)模式上表現(xiàn)出明顯的差別，在非生物脅迫（冷、干旱、高鹽）壓力下23個表達(dá)有差異性；壓力誘導(dǎo)的CsWRKY 表達(dá)模式和擬南芥同系物的表達(dá)模式很相似（除了組ⅢCsWRKYs）［44］。歐洲大葉楊PtWRKY亞組III在各種壓力（冷、旱、高鹽、水楊酸）下表達(dá)，PtWRKY76在 0.1mmol/L的SA 或25％ PEG-6000（聚乙二醇，polyethylene glycol）處理下可以被劇烈地誘導(dǎo)出來［45］。番茄在不同的發(fā)育進(jìn)程和應(yīng)答各種的生物脅迫和非生物脅迫過程中，SlWRKY基因表現(xiàn)出不同的時空表達(dá)，18個選擇好的SlWRKY基因應(yīng)答干旱高鹽壓力和病菌感染壓力［40］。蓖麻正常發(fā)育情況下，RcWRKY基因無論在轉(zhuǎn)錄豐度水平還是在基因表達(dá)模式水平上都表現(xiàn)出差異性［34］。巴豆在正常發(fā)育情況下根、莖、葉、種子4種組織的表達(dá)數(shù)據(jù)揭示，47個JcWRKY基因至少可應(yīng)答一種非生物脅迫壓力（干旱、鹽堿、磷酸饑餓、氮饑餓）［36］。中國白菜葉片BrWRKY基因應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫壓力時的表達(dá)模式有差異和相似性［32］。番木瓜TF807.3、72.14在低溫下上調(diào)，TF807.3、43.76、12.199、12.62涉及到了干旱壓力，TF9.35、18.51、72.14、12.199涉及到了受傷反應(yīng)，TF12.199、807.3、21.156、18.51被病原體誘導(dǎo)，TF72.14、43.76被 ABA誘導(dǎo)［48］。二穗短柄草BdWRKY基因的表達(dá)快速地被各種壓力和植物激素所調(diào)節(jié)［28］。橡膠樹組織特異性表達(dá)模式檢測結(jié)果顯示74個HbWRKYs至少在一種檢測組織中表達(dá)，而其他7個HbWRKY則在所有檢測組織中表達(dá)量較低，說明HbWRKYs參加細(xì)胞內(nèi)的各種進(jìn)程；在嫩枝植株加入JA和ET試劑處理后觀察選擇20個HbWRKY基因（其中13個在乳膠中富含）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其中17個HbWRKY至少應(yīng)答一種試劑，說明HbWRKY被JA和ET信號通路調(diào)控［37］。15個菊花的CmWRKY基因應(yīng)答各種植物激素處理、生物脅迫、非生物脅迫（qRT-PCR）［53］。檢測了大豆被P. pachyrhizi感染后8個GmWRKY基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與敏感型植株相比，抗性型植株的這些基因表達(dá)的更早更強(qiáng)［47］。qRT-PCR檢測61個歐洲大葉楊PtWRKY基因的組織特異性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有46個表達(dá)在各種組織中（根、莖、葉等），且不同組織中的表達(dá)模式大不相同，18個PtWRKY基因被一種或多種壓力處理時表達(dá)且轉(zhuǎn)錄豐度相對高；過量表達(dá)SA誘導(dǎo)的基因PtrWRKY89，加速PR蛋白的表達(dá)且改善轉(zhuǎn)基因楊樹對病菌的抗性，說明PtrWRKY89是楊樹中SA依賴的防御信號通路的調(diào)節(jié)子［5］。檢驗小白菜葉片，共有22個BcWRKYs在應(yīng)答至少一種壓力狀況下（脫落酸、冷、高鹽、熱、高滲）差異性地表達(dá)，共表達(dá)分析結(jié)果顯示壓力誘導(dǎo)的BcWRKYs共調(diào)控多個非生物脅迫壓力應(yīng)答信號通路；BcWRKY-33、-40、-53和-70 作為核心調(diào)節(jié)子，在壓力誘導(dǎo)的BcWRKYs 共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起主要作用［30］。

有些研究用了不止qRT-PCR一種手段。用微陣列芯片Br135K（針對所有BrWRKY基因設(shè)計）和RT-PCR（以根莖葉等特異組織為模板）分析，發(fā)現(xiàn)中國白菜BrWRKY的表達(dá)有一定的組織特異性，大白菜亞種Chiifu和Kenshin對冷、干旱、高鹽、病菌侵染的BrWRKY應(yīng)答表達(dá)模式不相同［31］。葡萄的7種組織（幼葉、成熟葉、葉卷須、莖尖、根、幼果、成熟果實）中檢測VvWRKYs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大部分至少在兩種組織中表達(dá)；36種VvWRKYs在冷壓力下表達(dá)水平改變；結(jié)合各種數(shù)據(jù)分析（基因芯片、qRT-PCR、全局轉(zhuǎn)錄組）鑒定出15種VvWRKYs應(yīng)答冷壓力，其中3個VvWRKY基因可以被ABA所誘導(dǎo)［50］。棉花的微陣列芯片、表達(dá)模式數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果顯示，GhWRKY可能調(diào)節(jié)纖維、花藥、組織（根、莖、葉、胚胎）的發(fā)育，且涉及到了壓力應(yīng)答；表達(dá)模式分析結(jié)果顯示大部分的組Ⅱ和組ⅢGhWRKY在各種壓力下高度表達(dá)；而代表著祖先狀態(tài)的組Ⅰ在壓力下的表達(dá)量低，似乎對各種壓力都不敏感［39］。2014年，Wang等［55］用 qRT-PCR和RNA測序方法分析了雙單倍體（di-haploid）楊樹（Populus simonii×P. nigra）的51個WRKY基因（共119個）在應(yīng)答高鹽壓力的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)有13個PthWRKY基因在高鹽處理后在根莖葉組織中表達(dá)但它們的表達(dá)模式很不相同，根據(jù)表達(dá)量可分為3組：組Ⅰ（PthWRKY-28、-45、-105）表達(dá)量低，組Ⅱ（PthWRKY-56、-88、-116）中等，組Ⅲ（PthW RKY-41、-44、-51、-61、-62、-75、-106）高 ；組Ⅱ和組Ⅲ的“誘導(dǎo)擴(kuò)增-恢復(fù)”的動態(tài)表達(dá)模式或許說明它們在調(diào)控高鹽應(yīng)答上作用很重要。

3.2.2 微陣列基因芯片 芯片檢測到大麥一些特殊的表達(dá)模式；在單子葉植物（大麥）和雙子葉植物（擬南芥）之間的WRKY基因有保守保留的功能［21］。玉米WRKY基因或許參與了其生長和發(fā)育的調(diào)控，涉及到了干旱壓力和病菌感染的應(yīng)答［23］。胡楊對長時程干旱壓力的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄豐度上改變的基因包括一些轉(zhuǎn)錄因子家族，如WRKY、AP2/EREPB、bZIP等［56］。 一 大 批 葡 萄VvWRKYs應(yīng)答各種壓力而激活［50］。6個銹病相關(guān)的小麥微陣列芯片數(shù)據(jù)分析后支持功能注釋結(jié)論，即TaWRKY應(yīng)答抗病反應(yīng)；兩者分析結(jié)果的主要代表是 TaWRKY-10、-15、-17、-56［26］。 用 superSAGE、微分離創(chuàng)傷后的RNA測序、微陣列芯片檢驗到75個大豆GmWRKY基因涉及大豆銹菌（Phakopsora pachyrhizi）感染應(yīng)答的功能［47］。

3.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序 中國白菜的根、莖、葉等組織的BrWRKY有組織特異性表達(dá)和差異性表達(dá)模式［32］。大豆正常生長狀況下的127個GmWRKY基因在RNA轉(zhuǎn)錄豐度和基因表達(dá)模式水平上都具有顯著的差異性［46］。棉花WRKY基因參與到了不同棉花亞種特殊纖維的發(fā)育；在二倍體棉花和四倍體棉花的纖維發(fā)育過程中，復(fù)雜的WRKY基因表達(dá)模式也被觀察到，如G. hirsutum中差異性的等位基因Dt和At的基因表達(dá)及可變剪切事件［38］。利用公布的RNA-Seq數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄組水平分析了小麥TaWRKYs基因?qū)Ω珊祽?yīng)答的情況，在耐旱品種Sivas 111/33和易旱品種Atay 85植株的根和葉片組織中檢測了TaWRKY16/16-A、TaWRKY-17、-19-C，-24、-59、-61、-82的 相 對表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，Sivas 111/33根組織中的以上所有基因的量都上調(diào)了，其中小麥應(yīng)答干旱的基因TaWRKY-16、-24、-59、-61、-82 是 首 次 發(fā) 現(xiàn)［25］。2014年，Huang等［57］RNA測序了成熟前和成熟后中國梨（Pyrus ussuriensis）的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了3 729個差異表達(dá)的基因，含有PuWRKYs。高通量轉(zhuǎn)錄組分析鑒定出61個歐洲大葉楊PtWRKY基因應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫壓力［5］。

4 問題與展望

目前WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究還主要集中在單個基因的克隆、表達(dá)和功能方面，它們的具體作用機(jī)制還不完全清楚。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和各植物基因組測序信息的公布，使得大規(guī)模全基因組水平鑒定WRKY基因家族以及研究它們在各種壓力應(yīng)答下的基因表達(dá)模式成為可能。這樣的整體性研究會為單個WRKY基因作用機(jī)制研究提供一定的預(yù)測。文獻(xiàn)分析結(jié)果顯示，目前全基因組鑒定WRKY基因家族，主要局限在WRKY的生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的初步研究，較少有涉及其信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精細(xì)機(jī)制。完善各種環(huán)境壓力應(yīng)激條件下WRKY的表達(dá)模式研究，利用包括二代測序mRNA-seq和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，研究其基因表達(dá)變化，同時結(jié)合ChIP-seq技術(shù)，研究全基因組水平WRKY的結(jié)合靶基因，構(gòu)建WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析不同應(yīng)激條件下WRKY通過哪些靶基因和通路起到抵抗應(yīng)答作用等，將是未來的研究熱點。

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