黃柏抑菌成分超聲波提取工藝研究

呂君一潘健于佳霖于洋*（遼寧省沈陽(yáng)市第二中學(xué)0866；沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

黃柏抑菌成分超聲波提取工藝研究

呂君一1潘健2于佳霖2于洋2*
（1遼寧省沈陽(yáng)市第二中學(xué)110866；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

采用超聲波法提取黃柏中抑菌成分，實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用。以生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌率，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了溶劑濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率和提取次數(shù)等因素對(duì)黃柏提取物抑菌效果的影響，結(jié)果表明，采用85%乙醇作為提取溶劑、料液比為1∶25、超聲時(shí)間15min、超聲功率800W、連續(xù)提取2次的提取條件下測(cè)得的抑菌率最高、效果最好。

黃柏；西瓜枯萎病菌；分離；抑菌活性

隨著人們環(huán)保意識(shí)的日益增強(qiáng)，對(duì)高效、低毒農(nóng)藥的需求也日益強(qiáng)烈。植物是自然界中生物活性物質(zhì)的天然寶庫(kù)，植物次生代謝產(chǎn)物在提高自身保護(hù)和生存競(jìng)爭(zhēng)能力及協(xié)調(diào)與環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)著重要角色［1］，如類(lèi)黃酮、萜烯類(lèi)、甾體、生物堿、酚類(lèi)等均具有抗菌或殺蟲(chóng)活性。植物源農(nóng)藥具有高效、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性、易與其他農(nóng)藥混配等特點(diǎn)，成為目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的主要來(lái)源之一［2］。黃柏是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，為雙子葉植物藥蕓香科植物黃柏或黃皮樹(shù)的樹(shù)皮［3］，黃柏主產(chǎn)區(qū)在遼寧、吉林、河北、四川、貴外、湖北、云南等地，黃皮樹(shù)分布在四川、湖北、貴州、云南、江西、浙江等地。黃柏主要成分為小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、黃柏堿、掌葉防己堿等生物堿，及黃柏酮、黃柏內(nèi)醑、7-脫氫豆甾醇、β-谷甾醇、黏液質(zhì)等［4］。相關(guān)研究表明，黃柏提取物可抑制水稻稻瘟病原菌的孢子萌發(fā)［5］；黃柏果實(shí)提取物對(duì)小麥紋枯病菌和稻紋枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用［6］。黃柏產(chǎn)地豐富、易采集，針對(duì)黃柏中具有抑菌活性的化學(xué)成分，建立快速、高效提取分離與篩選鑒定活性物質(zhì)的方法具有重要意義。西瓜枯萎病是生產(chǎn)中重要的土傳病害，目前簡(jiǎn)單、快速、有效的藥劑防治法仍是生產(chǎn)上防治該類(lèi)病害的主要措施。本文報(bào)道了黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌活性，并通過(guò)單因素、正交試驗(yàn)確定其最佳提取工藝，旨在為其今后應(yīng)用于植物病蟲(chóng)害的防治提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

黃柏購(gòu)自沈陽(yáng)同仁堂藥房。供試提取溶劑有乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合溶劑（乙醇∶丙酮=2∶1）。西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所園藝作物病害與控制研究組提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1黃柏抑菌活性物質(zhì)的制備取粉碎的黃柏10.0g，按料液比加入一定濃度的提取溶劑，用超聲波提取法提取抑菌活性物質(zhì)。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加無(wú)菌蒸餾水定容至0.25g/mL，0～4oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抑菌試驗(yàn)取一定質(zhì)量濃度的黃柏提取液1.0mL，加入9.0mL熱PDA培養(yǎng)基，搖勻，對(duì)照組中加入等量無(wú)菌水，倒入融化的PDA培養(yǎng)基至10.0mL，搖勻，制成平板。接種生長(zhǎng)一致的供試菌菌餅（Φ= 6.0mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，25℃下培養(yǎng)，分別于第4d、第7d用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑。抑菌試驗(yàn)共2個(gè)處理（培養(yǎng)基加提取液和培養(yǎng)基加無(wú)菌水），每處理3次重復(fù)。菌落生長(zhǎng)直徑（mm）=菌落直徑平均值-6.0mm；菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=［（對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑］×100。

1.2.3提取工藝的優(yōu)化以抑菌率為考察指標(biāo)，單因素試驗(yàn)乙醇濃度、料液比、超聲波時(shí)間、超聲波功率等因素對(duì)黃柏有效抑菌成分提取率的影響，數(shù)據(jù)分析利用SPSS11.5。結(jié)合單因素試驗(yàn)，選擇乙醇濃度、料液比、回流時(shí)間、提取功率為影響因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），優(yōu)化黃柏有效抑制西瓜枯萎病菌成分的最佳提取工藝。

1.2.4最佳提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)選定西瓜枯萎病進(jìn)行離體抑菌試驗(yàn)，驗(yàn)證黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1黃柏不同溶劑提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑制作用

乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合液等3種溶劑的黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制作用（見(jiàn)表2）。其中，70%乙醇提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌效果均較好，確定乙醇為提取溶劑。

表2　不同溶劑提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.2黃柏乙醇提取物使用濃度的確定

隨著黃柏提取物濃度的降低，抑菌率明顯降低（見(jiàn)表3）。黃柏乙醇提取物質(zhì)量濃度為2.00g/mL時(shí)，抑菌效果最好，但抑菌率過(guò)高不利于最佳提取條件試驗(yàn)的確定，為了后期試驗(yàn)有序進(jìn)行，故選擇0.25g/mL為后續(xù)試驗(yàn)濃度。

表3　不同濃度的黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1乙醇濃度對(duì)黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的不同濃度乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表4可知，乙醇濃度為80%時(shí)，黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

2.3.2料液比對(duì)黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入不同料液比的80%乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表5可知，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

表4　不同乙醇濃度的提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

表5　不同料液比的提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.3超聲波時(shí)間對(duì)黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的80%乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表6可知，超聲波時(shí)間為20min和40min時(shí)，黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌效果均較好，且差異不顯著（p<0.05），故選取超聲時(shí)間為20min。

表6　不同超聲波時(shí)間的提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.4超聲波功率對(duì)黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的80%乙醇，在提取溫度40℃、不同超聲功率下提取20min，提取2次。由表7可知，當(dāng)超聲波功率為800w時(shí)，黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌效果最好。

表7　不同超聲波功率的提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.4對(duì)西瓜枯萎病菌抑菌效果的正交試驗(yàn)

由極差分析可以看出（見(jiàn)表8），針對(duì)西瓜枯萎病菌，各因素影響黃柏抑菌活性物質(zhì)抑菌效果的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?、料液比、超聲波功率、超聲波時(shí)間，即乙醇濃度影響最大，超聲波時(shí)間影響較小。針對(duì)西瓜枯萎病菌提取黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝為A3B3C1D2，即乙醇濃度為85%、料液比為1∶25、超聲時(shí)間為15min、超聲功率為800w。

表8　L9（34）對(duì)西瓜枯萎病菌抑菌作用的正交試驗(yàn)

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

比較單因素最佳組合提取工藝與上述3種提取工藝的抑菌效果。由表9可知，提取工藝A3B3C1D2的黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的4d、7d抑菌效果最佳，確定黃柏抑菌成分的最佳提取工藝為A3B3C1D2，即85%乙醇濃度、料液比為1∶25、超聲時(shí)間為15min、超聲功率為800w。

表93　種提取工藝的提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌率

3　討論與結(jié)論

近年來(lái)，從天然資源中尋找抗菌、殺蟲(chóng)活性物質(zhì)代替化學(xué)農(nóng)藥已成為植物保護(hù)研究中的熱點(diǎn)。我國(guó)有豐富的中草藥資源，是開(kāi)發(fā)植物源抗菌劑的理想來(lái)源?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已表明，黃柏具有抗病原微生物、抗炎、抗?jié)儭⒔祲?、抗心律失常、解熱等作用?～8］，但關(guān)于黃柏在抗植物病原菌方面的研究及應(yīng)用還少見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)確定了黃柏的乙醇提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制作用，但其具體的抑菌作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定超聲波提取法提取黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳條件為：以85%乙醇作為提取溶劑、料液比1∶25、超聲時(shí)間15min、超聲功率800w、連續(xù)提取2次。本研究針對(duì)黃柏提取物對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌活性及其提取方法方面進(jìn)行了初步探索，為深入研究其抗菌活性成分，以及植物源殺菌劑和黃柏資源的開(kāi)發(fā)與利用提供依據(jù)。

［1］SheltonAL.Variablechemicaldefencesinplants andtheireffectsonherbivorebehaviour[J].EvolutionaryEcology Research，2000，2（2）：231～249.

［2］王愛(ài)軍，袁叢英.綠色生物農(nóng)藥研究現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.河北化工，2006（1）：54～56.

［3］鄔家林.川黃柏藥材資源的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，1994，9（2）：13～15.

［4］胡俊青，胡曉.黃柏化學(xué)成分和藥理作用的現(xiàn)代研究［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15（7）：139～141.

［5］潘波，蔡麗麗，關(guān)麗杰.22種中草藥提取物的抑菌活性研究［J］.沈陽(yáng)化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，21（4）：257～260.

［6］唐靜，周立剛，周亞明，等.黃柏果實(shí)提取物對(duì)植物病原真菌的抑制作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2008（20）：505～507.

［7］肖培根.新編中藥志：第3卷［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002∶664～670.

［8］龔淼.黃柏的化學(xué)成分和藥理作用研究［J］.中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2009，9（4）：318～320.

。