白假絲酵母菌最優(yōu)化　RNA提取策略的探索

李賽男，祁文瑾

白假絲酵母菌最優(yōu)化RNA提取策略的探索

李賽男，祁文瑾

目的 探索白假絲酵母菌總RNA簡單、快捷、高效的提取方法。方法 選取昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診2011年7月—2013年3月有臨床癥狀且陰道分泌物鏡檢陽性的外陰陰道假絲酵母菌?。╒VC）患者的白假絲酵母菌40株，選用不同時間與溫度組合下的4種溶壁酶（Lyticase）破壁方案（A方案：37℃、12 h，B方案：25℃、12 h，C方案：37℃、24 h，D方案：25℃、24 h）進行RNA提取，將所得RNA進行熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)驗證RNA的濃度及純度，并進行管家基因18S rRNA的檢測。結(jié)果 D方案提取獲得的RNA濃度高于A、B、C方案（P＜0.05）；B方案提取獲得的RNA濃度高于A、C方案（P＜0.05）；而A、C兩方案提取獲得的RNA濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。B、D方案獲得的RNA純度高于A、C方案 （P＜0.05）；但A、C方案獲得的RNA純度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B方案提取獲得的RNA純度高于D方案（P＜0.05）。A、B、C、D方案提取的RNA擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中B、D方案qPCR擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值高于A、C方案（P＜0.05）；但B、D方案及A、C方案之間的 qPCR擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。管家基因18S rRNA的引物擴增出的產(chǎn)物片段大小為150 bp。結(jié)論 以Lyticase破壁提取白假絲酵母菌具有簡單易行及RNA產(chǎn)量高、純度好的優(yōu)點，值得臨床推廣應(yīng)用。

白假絲酵母菌；RNA；聚合酶鏈反應(yīng)；溶壁酶

李賽男，祁文瑾.白假絲酵母菌最優(yōu)化RNA提取策略的探索［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18（2）：176-179. ［www.chinagp.net］

Li SN，Qi WJ.Strategy of optimizing RNA extraction from candida albicans［J］.Chinese General Practice，2015，18 （2）：176-179.

外陰陰道假絲酵母菌病 （vulvovaginal candidisis，VVC）是常見的外陰陰道感染性疾病，是由假絲酵母菌感染引起的陰道黏膜和/或外陰真菌感染。對假絲酵母菌分子生物學(xué)水平的研究常需提取其總 RNA，由于假絲酵母菌細(xì)胞壁主要是由幾丁質(zhì)組成，壁厚且堅硬，破壁一直是假絲酵母菌總RNA提取的關(guān)鍵步驟。目前，常用的假絲酵母菌破壁方法有：-80℃研磨破壁法、液氮研磨破壁法、酸洗玻璃珠破壁法［1-2］、Trizol法、改進Trizol法、超聲粉碎法［3］、熱酚法及改良熱酚法［4］等，大多數(shù)方法對實驗室要求較高，費時費力，且可能對環(huán)境和實驗者造成一定危害。本研究旨在通過改良假絲酵母菌的破壁方法來獲得一種理想的白假絲酵母菌RNA提取方法。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株 選取昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診2011年7月—2013年3月有臨床癥狀且陰道分泌物鏡檢陽性的VVC患者的白假絲酵母菌40株，以沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基（生物梅里埃，法國）培養(yǎng)獲得純化菌株，經(jīng)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基、安圖顯色培養(yǎng)基和Vitek（生物梅里埃，法國）菌種鑒定法確定為白假絲酵母菌后傳代培養(yǎng)。菌株涂布于沙堡羅氯霉素平皿培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于沙堡羅氯霉素斜面培養(yǎng)基常溫保存，每半年轉(zhuǎn)種于新制成的沙堡羅氯霉素斜面培養(yǎng)基一次，以保證菌株活性。

1.1.2主要試劑 沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基（生物梅里埃，法國）、溶壁酶（Sigma，美國）、1 M山梨醇、0.1 M EDTA（pH=7.4）、0.1%β-巰基乙醇、用焦碳酸二乙酯 （DEPC）處理水制備的70%乙醇、三氯甲烷、無水乙醇、Ultrapure RNA Kit（中國康為世紀(jì)公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 （中國TransGenic公司）、UltraSYBR Mixture（中國康為世紀(jì)公司）。

1.1.3實驗儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）、PCR儀（BIO-RAD，美國）、紫外可見分光光度計 （NanoDrop，美國）、POWER PAC3000（BIORAD，美國）、凝膠成像分析系統(tǒng)（中國香港基因有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1菌株準(zhǔn)備 以無菌接種環(huán)挑取保存的純化菌株接種于沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)備用。

1.2.2白假絲酵母菌破壁 將37℃過夜培養(yǎng)的相同量白假絲酵母菌菌落溶于1 M山梨醇、0.1 M EDTA的液體中，使溶液OD600值在0.6～1.0，后置于1.5 ml eppendorf管中，加入0.1%β-巰基乙醇和50個單位溶壁酶，按照不同破壁時間和溫度處理至溶液清亮。所用破壁溫度和時間組合方案 （分別以A、B、C、D表示）詳見表1。破壁后將清亮溶液置于4℃，5 000 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，棄上清液得到白色細(xì)胞團。

表1　白假絲酵母菌破壁的4種組合方案Table 1 Four methods for disrupting the cell wall of Candida albicans

1.2.3RNA提取 使用Ultrapure RNA Kit，按照說明書提取假絲酵母菌總RNA。

1.2.4RNA定量 將以上不同條件處理所提取的RNA溶于20 μl RNase-Free Water中，取1 μl用NanoDrop （ND-1000）測量濃度，并以 A260/A280判定其純度（以RNase-Free Water調(diào)零）。其余RNA立即置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5RNA反轉(zhuǎn)錄 使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京Transgen公司）進行cDNA合成。反應(yīng)體系為20 μl，包含7 μl RNA，1 μl Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg/μl），10 μl 2×TS Reaction Mix，1 μl TranScript RT/ RI Enzyme Mix，1 μl gDNA Remover。以42℃孵育30 min。得到的cDNA置于-20℃冰箱保存。

1.2.6檢測管家基因 以熒光定量PCR檢測白假絲酵母菌中管家基因18S rRNA的表達(dá)［5］。反應(yīng)體系為15 μl，包括7.5 μl 2×UltraSYBR Mixture，4.3 μl RNase-Free Water，2.0 μl Template DNA，上下游引物各0.6 μl，引物序列為：正向引物5′-TCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG-3′，反向引物5′-TCGATAGTCCCTCTAAGAAGTG-3′。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃40個循環(huán)15 s，60℃ 退火1 min。以每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）來定量計算基因表達(dá)的效果，比較時把 Ct值轉(zhuǎn)化為2-ΔCt進行。對熒光定量 PCR（qPCR）的產(chǎn)物進行瓊脂糖（西班牙瓊脂糖）凝膠電泳跑膠（跑膠是為了驗證目的片段能否有效擴增以及對比Marker排除引物二聚體），使用POWER PAC3000電泳儀，180 V 20 min，Marker為TAKARA的DL500 DNA Marker。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，不同提取方案獲得的RNA濃度與純度的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同方案提取的RNA濃度與純度比較 D方案提取獲得的RNA濃度高于A、B、C方案，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；B方案提取獲得的RNA濃度高于A、C方案，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；而A、C兩方案提取獲得的RNA濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B、D方案獲得的 RNA純度高于A、C方案，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；但A、C方案獲得的RNA純度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B方案提取獲得的RNA純度高于D方案，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05，見表2）。

2.2管家基因18S rRNA的擴增結(jié)果 不同方法提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qPCR反應(yīng)。A、B、C、D方案提取的RNA擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；其中B、D方案qPCR擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值高于A、C方案，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但B、D方案比較及 A、C方案比較 qPCR擴增產(chǎn)物Ct轉(zhuǎn)化值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。為了驗證Ct值的可靠性，對qPCR的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳跑膠，結(jié)果證明管家基因18S rRNA的引物擴增出的產(chǎn)物片段大小為150 bp，相對應(yīng)的qPCR產(chǎn)物與其Ct值是可信的，且與Marker對比，確定所擴增的產(chǎn)物是目的基因（見圖1、2）。

表2　不同方案提取RNA的濃度、純度及擴增結(jié)果比較　（±s）Table 2 Comparison of the purity and quality of extracted RNA of Candidaalbicans in different scenarios

表2　不同方案提取RNA的濃度、純度及擴增結(jié)果比較　（±s）Table 2 Comparison of the purity and quality of extracted RNA of Candidaalbicans in different scenarios

注：與A方案比較，*P＜0.05；與B方案比較，△P＜0.05；與C方案比較，▲P＜0.05

方案　株數(shù)　濃度（mg/L）　純度（A260/A280）　18S rRNA（2-ΔCt）A　40　44.7±11.7　1.81±0.14　0.02±0.63 B　40　127.8±41.2*　2.08±0.14*　0.22±0.17*C　40　52.8±16.8△　1.78±0.17△　0.01±0.01△D　40　217.6±67.5*△▲　2.07±0.07*△▲　0.20±0.17*▲F值＜0.001?。?.001?。?.001 255.004　213.310　32.625 P值

圖1　qPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 The result of the product after qPCR

圖2　不同方案下qPCR擴增18S rRNA的曲線圖Figure 2 Amplification curves of 18S rRNA under different scenarios of qPCR

3　討論

VVC是常見的婦產(chǎn)科感染性疾病，占微生物所致陰道炎的25.0%～30.0%，強烈的局部癥狀及易于復(fù)發(fā)為其特點。在1年內(nèi)VVC癥狀發(fā)作≥4次者定義為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。≧VVC）［6-7］。隨著臨床廣譜抗生素的大量應(yīng)用，假絲酵母菌引起的感染耐藥現(xiàn)象日益突出，并受到廣泛關(guān)注。有研究顯示，MDR、CDR、PDR等基因表達(dá)的異常可能是白假絲酵母菌耐藥的機制，對這一機制的深入研究需以提取高質(zhì)量的RNA為前提。由于假絲酵母菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，要想獲得理想濃度和純度的RNA十分困難。

目前，國內(nèi)外學(xué)者提取假絲酵母菌常用的方法有超聲波法、玻璃珠漩渦振蕩、熱酸性酚法、液氮研磨法、反復(fù)凍融法等，也有少部分學(xué)者使用過蝸牛酶破壁法［2-3，8］。在這些方法中，超聲波法和玻璃珠漩渦振蕩會打斷RNA鏈，形成小分子RNA，不適于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗要求［9］。熱酸性酚法耗時長，所用試劑多且實驗中加入的酚類物質(zhì)不易除去，最終易與RNA形成褐色復(fù)合物而導(dǎo)致RNA完全喪失生物學(xué)活性［10-11］。而液氮研磨法、反復(fù)凍融法等常用破壁方法雖然效果較好，但操作步驟繁瑣，不適于大樣本RNA的提取。蝸牛酶在很多年前就被用于破壁提取真菌的 DNA，但蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，其含有20多種酶，主要是纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶等，是一種含有多種生物活性的混合酶，目前很難確定其在假絲酵母菌 RNA提取時對 RNA濃度、純度的影響。

溶壁酶來自藤黃節(jié)桿菌（Arthrobacter luteus），是一種可以裂解活酵母細(xì)胞的放線菌所產(chǎn)生的酶，其中β -1，3-葡聚糖酶在裂解過程中起著關(guān)鍵作用。其能溶解許多真菌（包括擔(dān)子菌、子囊菌、藻狀菌和半知菌）的細(xì)胞壁而獲得有活性的原生質(zhì)體。近年來，有學(xué)者利用溶壁酶對真菌細(xì)胞壁的溶壁作用對VVC進行治療，并且取得較好的效果。本研究以此為基礎(chǔ)，創(chuàng)造性地選用溶壁酶進行假絲酵母菌破壁，并選用不同破壁時間和溫度的組合來確定最佳的RNA抽提方案。結(jié)果提示，不同溫度處理后RNA提取的產(chǎn)物濃度差異較大，處理的時間也對RNA的濃度有一定影響。在25℃時處理24 h左右（D方案）破壁效果最佳，經(jīng)過此條件處理后可以提取到較高濃度和純度的RNA。此外，本研究還對提取獲得的總RNA進行了qPCR擴增，均獲得了理想的18S rRNA擴增結(jié)果，證實除此提取方法能夠充分滿足后續(xù)試驗的要求外，還進一步證實了溶壁酶破壁提取RNA的可行性。此外，本研究應(yīng)用的溶壁酶破壁RNA提取的方法避免了超聲波法和玻璃珠漩渦振蕩對RNA片段的影響、酚類物質(zhì)對RNA活性的影響，還避免了液氮研磨法、反復(fù)凍融法等對實驗室條件要求高等不足，具有簡單易行，RNA提取質(zhì)量高、純度好的優(yōu)點，值得推廣運用。

［1］Su HC，Cheng B，F(xiàn)u LX，et al.Comparison of three different methods to extract Candida RNA by breaking cell walls［J］.Chinese Journal of Mycology，2007，2（5）：286-288.（in Chinese）蘇惠春，程波，傅冷西，等.3種破壁方法提取念珠菌總RNA效果的比較［J］.中國真菌學(xué)雜志，2007，2（5）：286-288.

［2］Pan C，Wei X，Liu WH.A preliminary study on total RNA isolation by modified Trizol method［J］.Journal of Clinical Stomatology，2007，23（9）：531-533.（in Chinese）潘琤，魏昕，劉衛(wèi)紅.改進Trizol法提取白色念珠菌總RNA初探［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（9）：531-533.

［3］Zhang Y，Ma M，Yu LH，et al.A study on total RNA isolation from early Candida albicans biofilm by modified hot phenol method［J］. Oral Biomedicine，2010，1（2）：65-67.（in Chinese）張琰，馬鳴，虞麗華，等.改良熱酸酚法提取白色念珠菌早期生物膜總RNA的研究 ［J］.口腔生物醫(yī)學(xué)，2010，1（2）：65 -67.

［4］Chen LM，Xu YH，Zhou CL，et al.Overexpression of CDR1 and CDR2 genes plays an important role in fluconazole resistance in Candida albicans with G487T and T916C mutations［J］.Journal of International Medical Research，2010，38（2）：536-545.

［5］Yang H，Ye Y，Wang YC，et al.Research on strain and drug tolerance of vulvovaginal candidiasis［J］.Journal of Practical Obstetrics and Gynecology，2010，26（10）：756-758.（in Chinese）陽華，葉元，王玉春，等.外陰陰道假絲酵母菌病的菌種與耐藥性研究［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2010，26（10）：756-758.

［6］Taskova RM，Zorn H，Krings U，et al.A comparison of cell wall disruption techniques for the isolation of intracellular metabolites from Pleurotus and Lepista sp［J］.Z Naturforsch C，2006，61（5/6）：347-350.

［7］Yilmaz R，Ak?a O，Baloglu MC，et al.Optimization of yeast （Saccharomyces cerevisiae）RNA isolation method for real-time quantitative PCR and microarray analysis［J］.African Journal of Biotechnology，2014，11（5）：1046-1053.

［8］Yi Y，Rong YP，Cheng QW，et al.Comparison of different cell wall disruption methods for yeast total RNA extraction［J］.Food Science，2011，32（11）：161-164.（in Chinese）易弋，容元平，程謙偉，等.不同破壁方法提取酵母菌總 RNA的比較 ［J］.食品科學(xué)，2011，32（11）：161-164.

［9］Yu HS，Peng S，Xie YH，et al.Study on improvement of RNA isolating reagent Kit-TRIZOL［J］.Food Science，2005，26 （11）：39-42.（in Chinese）于寒松，彭帥，謝遠(yuǎn)紅，等.一種RNA提取試劑盒——TRIZOL的使用方法初探［J］.食品科學(xué)，2005，26（11）：39-42.

［10］Morozov IA，Sachivkina NP，Kravtsov EG，et al.Damaging effects of lyticase on Candida albicans and changes in the response of rat alveolar macrophages to the contact with yeast-like fungi［J］. Bulletin of Experimental Biology and Medicine，2011，151（6）：705-708.

［11］Sachivkina NP，Kravtsov EG，Wasileva EA，et al.Efficiency of lyticase（bacterial enzyme）in experimental candidal vaginitis in mice ［J］.Bulletin of Experimental Biology and Medicine，2010，149 （6）：727-730.

（本文編輯：李婷婷）

Strategy of Optimizing RNA Extraction from Candida Albicans

LI Sai-nan，QI Wen-jin.Department of Obstetrics andGynecology，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China

Objective To explore a simple，rapid and effective solution of extracting RNA from Candida albicans （C.albicans）.Methods From July 2011 to March 2013，in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，40 isolates simulated from vaginal secretion were identified as C.albicans.This study chose 4 Lyticase disrupting-wall programs at different time and temperatures（program A：37℃，12 h；program B：25℃，12 h；program C：37℃，24 h；program D：25℃，24 h）to extract RNA.The concentrations and purity of the extracted RNA were verified by real-time fluorescent quantitative PCR（qPCR）reaction and housekeeping gene 18S rRNA detection performed.Results The RNA concentration of program D was higher than those of programs A，B，C，the difference was significant（P＜0.05），that of program B was higher than those of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs A，C（P＞0.05）.The RNA purity programs B，D was higher than those of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs A，C （P＞0.05）.RNA purity of program B was higher than that of program D（P＜0.05）.There was difference in RNA amplified product Ct conversion value in programs A，B，C，D（P＜0.05），there into the qPCR amplified product Ct conversion value of programs B，D was higher than that of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs B，D and A，C（P＞0.05）.The product fragment size amplified by housekeeping gene 18S rRNA primers was 150 bp.Conclusion

Lyticase wall-disruption extacting C.albicans is simple，easy to operate，with high RNA products and good purity，which is worthy of promotion.

Candida albicans；RNA；Polymerase chain reaction；Lyticase

R 379.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.02.013

國家自然科學(xué)基金資助項目（81160076）

650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

祁文瑾，650032云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；E-mail：wenjinq@sohu.com

2014-06-21；

2014-10-11）