塑料袋混合營養(yǎng)培養(yǎng)小球藻技術(shù)

小球藻是第一個(gè)被人工培養(yǎng)的微藻，它可作為人類的食品及食品添加劑，也可作為水產(chǎn)動物人工育苗階段的餌料和飼料添加劑，還可作為培養(yǎng)輪蟲的餌料以及用于提取EPA、DHA、類胡蘿卜素、蝦青素等。此外，小球藻可用于調(diào)節(jié)水質(zhì)。

小球藻大規(guī)模培養(yǎng)研究可以分為兩個(gè)階段，1950－1979年主要進(jìn)行開放水池培養(yǎng)的研究，1980年開始進(jìn)行密閉和半密閉反應(yīng)器培養(yǎng)的研究。傳統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化微藻培養(yǎng)多利用開放的水池，微藻以光合自養(yǎng)的模式生長。而采用透明容器或玻璃管道設(shè)計(jì)的半密閉和密閉光照生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，藻類細(xì)胞的密度提高了6～12 倍，總體積相對減少，分離成本大大降低；各種生長因子及工藝可以采用自動化、集約化管理，提高了生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，可以避免受到其他生物和非生物的污染，但存在光反應(yīng)器一次性投資大、許多技術(shù)尚未完全解決的問題。近年來，小球藻的高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)也取得了巨大的進(jìn)步，大幅度提高了小球藻的生長速度，使小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能，然而其存在異養(yǎng)代謝過程同自養(yǎng)代謝或混養(yǎng)代謝有很大差異、對設(shè)備要求高、投資大等不足之處，普通水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)不愿意高投資進(jìn)行小球藻生產(chǎn)，而且設(shè)備的操作流程比較復(fù)雜和難以掌握。

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本技術(shù)利用小球藻可以進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)的特點(diǎn)，結(jié)合傳統(tǒng)的塑料袋培養(yǎng)方法，進(jìn)行簡化和優(yōu)化，通過提供混合營養(yǎng)生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和條件，改變小球藻傳統(tǒng)培養(yǎng)中僅進(jìn)行光合自養(yǎng)或異養(yǎng)的代謝方式，形成了利用塑料袋進(jìn)行小球藻混合營養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)。采用該技術(shù)培養(yǎng)小球藻，可有效提高藻類的培養(yǎng)效率，減少對設(shè)備的依賴和能源的消耗，從而縮減小球藻培養(yǎng)的成本，便于推廣應(yīng)用。

一、材料與方法

1.培養(yǎng)容器的選擇及前處理 選用容積為20～100升的透明塑料袋作為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容器在使用前用漂白粉溶液浸泡24小時(shí)后曝曬12小時(shí)備用；塑料袋可采用藻類培養(yǎng)專用塑料袋，也可采用蝦苗或魚苗運(yùn)輸用袋。

2.培養(yǎng)液的配制 培養(yǎng)液由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、葡萄糖、水組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基可選用BG11 培養(yǎng)基、f/2培養(yǎng)基或復(fù)合肥培養(yǎng)基，其中BG11和f/2為常用的藻類培養(yǎng)基，復(fù)合肥為俄羅斯阿康復(fù)合肥(N∶P∶K＝16∶16∶16)。葡萄糖的添加量為每升培養(yǎng)液中用0.5～1 克，這樣可為小球藻提供異養(yǎng)生長的條件，使小球藻在自然條件下有無光照均能生長，同時(shí)也可彌補(bǔ)單純使用無機(jī)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)小球藻導(dǎo)致的營養(yǎng)不均衡缺陷。

3.培養(yǎng)種類及接種 培養(yǎng)種類為普通小球藻。接種進(jìn)培養(yǎng)容器中的藻類為正處于指數(shù)生長期的小球藻，將處理后的培養(yǎng)容器裝培養(yǎng)液至容積的50%，培養(yǎng)容器內(nèi)裝入培養(yǎng)液后于9:00－11:00 進(jìn)行小球藻接種。接種的小球藻藻液的溫度與培養(yǎng)液的溫度基本保持一致，接種量為培養(yǎng)總量的10%左右，接種完成后培養(yǎng)容器密封于10℃以上的溫度條件下進(jìn)行混合營養(yǎng)培養(yǎng)。密封時(shí)，藻類培養(yǎng)專用塑料袋用封口蓋密封，蝦苗、魚苗尼龍袋用橡皮圈打結(jié)封口。光照采用自然光照，在氣溫較低時(shí)最好將培養(yǎng)容器放置在玻璃陽光房或塑料大棚內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

4.日常管理 接種完成后，將培養(yǎng)容器整齊擺放在有白色瓷磚的地面上，每天搖動培養(yǎng)容器至少4次，觀察培養(yǎng)容器內(nèi)藻類的生長情況，并用紫外分光光度計(jì)測量藻液的光密度(OD)值。通常在接種的第2天開始，塑料袋內(nèi)溶液色澤稍微變濃且有小氣泡產(chǎn)生，表明小球藻生長正常；接種后兩天若袋內(nèi)顏色沒有變化或無氣泡產(chǎn)生，且顏色灰黃，表明接種失敗，應(yīng)及時(shí)放棄、清理。當(dāng)培養(yǎng)容器內(nèi)的藻液變得濃綠時(shí)即可接種到其他藻類培養(yǎng)容器內(nèi)，接種方法與上述方法相同。在留夠足量藻種的情況下，可將培養(yǎng)的藻類用于輪蟲、枝角類和魚苗或蝦苗的培育。使用過的培養(yǎng)容器及塑料袋在保證沒有破損的前提下，經(jīng)漂白粉溶液消毒后方可用于下一次的培養(yǎng)。

二、結(jié)果

1. 20 升的平面藻類培養(yǎng)袋培養(yǎng) 在容積為20 升的平面藻類培養(yǎng)袋中使用BG11 作為藻類基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加葡萄糖量為1 克/升，進(jìn)行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10升，接種后的初始OD 值為0.091，培養(yǎng)4 天后藻類OD 值為1.201，細(xì)胞密度為1 835.24 萬個(gè)/毫升，細(xì)胞干重為0.25 毫克/毫升。使用f/2 作為藻類基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加葡萄糖1 克/升，進(jìn)行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10 升，接種后的初始OD 值為0.091，培養(yǎng)4 天后藻類OD值為0.974，細(xì)胞 干 重 為0.20 毫 克/毫升，細(xì)胞密度為1 481.02 萬個(gè)/毫升。使用復(fù)合肥培養(yǎng)基作為藻類基礎(chǔ)培養(yǎng)基，復(fù)合肥添加量為1 克/升，再添加葡萄糖1 克/升，進(jìn)行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10 升，接種后的初始OD 值為0.091，培養(yǎng)4 天后藻類OD 值為0.641，細(xì)胞密度為963.32 萬個(gè)/毫升，細(xì)胞干重為0.14 毫克/毫升。

2. 40升的魚苗尼龍袋培養(yǎng) 在容積為40升的魚苗尼龍袋中使用復(fù)合肥培養(yǎng)基作為藻類基礎(chǔ)培養(yǎng)基，復(fù)合肥添加量為1 克/升，再添加葡萄糖1克/升，進(jìn)行小球藻培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)體積為10升，接種后的初始OD值為0.092，培養(yǎng)5天藻類OD 值為0.601，細(xì)胞密度為901.04 萬個(gè)/毫升，細(xì)胞干重為0.13毫克/毫升。

三、討論

從具體培養(yǎng)的結(jié)果看，利用塑料袋進(jìn)行小球藻混養(yǎng)營養(yǎng)培養(yǎng)是可行的，而采用不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及采用不同的培養(yǎng)容器效果會有所區(qū)別。采用該技術(shù)培養(yǎng)小球藻，可有效提高小球藻的培養(yǎng)效率，以水池培養(yǎng)為對比，在水溫20～29℃，培養(yǎng)至第4 天，小球藻密度為856 萬個(gè)/毫升，而本方法培養(yǎng)至第4天最高(BG11作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)可達(dá)1 835.24 萬個(gè)/毫升，最少(復(fù)合肥作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基在尼龍袋中培養(yǎng))也可達(dá)到901.04 萬個(gè)/毫升。同時(shí)，因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中不需要充氣、不需要額外提供光照和加溫等，可減少對設(shè)備的依賴和能源的消耗，從而縮減了小球藻培養(yǎng)的成本，使得操作比較簡單，更便于進(jìn)行推廣應(yīng)用。