氟苯尼考單用及聯(lián)用對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果

唐萬(wàn)勇 劉 潔 侯 博, 朱秀高,3 丁文格 陳翠蘭

（1武漢回盛生物科技有限公司袁湖北武漢 430042；2湖北省獸藥工程研究中心袁湖北武漢 430042；3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院袁北京 100193）

氟苯尼考單用及聯(lián)用對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果

唐萬(wàn)勇1劉 潔2侯 博1,2朱秀高1,3丁文格1陳翠蘭2

（1武漢回盛生物科技有限公司袁湖北武漢 430042；2湖北省獸藥工程研究中心袁湖北武漢 430042；3中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院袁北京 100193）

為研究氟苯尼考和多西環(huán)素、甲氧芐啶、黏桿菌素的臨床配伍對(duì)副豬嗜血桿菌及胸膜肺炎放線桿菌感染的治療效果袁采用棋盤(pán)法測(cè)定氟苯尼考與其他三種抗生素聯(lián)合使用對(duì)上述兩種細(xì)菌的體外抑菌效果。結(jié)果表明:氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌具有協(xié)同作用 （FIC=0.75）；與甲氧芐啶聯(lián)合使用均表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用（FIC=1.5）；與黏桿菌素聯(lián)合使用對(duì)副豬嗜血桿菌呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用（FIC=2）袁而對(duì)胸膜肺炎放線桿菌呈現(xiàn)協(xié)同作用（FIC=0.75）。

副豬嗜血桿菌；胸膜肺炎放線桿菌；氟苯尼考；最小抑菌濃度；聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

氟苯尼考（Florfenicol）是一種化學(xué)合成的酰胺醇類(lèi)廣譜抗菌藥，最早于1979年上市，中國(guó)于1999年批準(zhǔn)使用，用于治療敏感菌引起的豬等動(dòng)物的細(xì)菌性疾病[1]。其作用機(jī)理是通過(guò)與細(xì)菌核糖體50s亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，由此起到抗菌作用。該藥具有抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、相對(duì)比較安全的特點(diǎn)，在養(yǎng)豬生產(chǎn)上，廣泛用于防治大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、各類(lèi)鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門(mén)氏菌等所致的細(xì)菌性疾病，尤其是在豬呼吸道疾病的控制中[2,3]。

副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌是豬的兩種重要的細(xì)菌性病原，尤其在豬呼吸道疾病的混合感染中起到重要作用。副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）由德國(guó)學(xué)者G lasser發(fā)現(xiàn)，于1910年首次報(bào)道，至少具有15個(gè)血清型，可導(dǎo)致多發(fā)性漿膜炎，包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。副豬嗜血桿菌病是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)最常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病[4]，在豬群的分離比例僅次于鏈球菌，占比達(dá)到22.5%[5]。胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus p leuropneumoniae,APP）由Pattison于1957年首次報(bào)道，到目前為止已知有15個(gè)血清型。胸膜肺炎放線桿菌是生長(zhǎng)育肥豬群的重要病原[4]，常導(dǎo)致豬只猝死、胸膜肺炎和生長(zhǎng)不良。由于HPS和APP血清型眾多，疫苗免疫常常面臨交叉保護(hù)作用不強(qiáng)的問(wèn)題，影響其防控效果，所以抗菌藥物成為控制這兩種病的主要手段，臨床上，氟苯尼考是控制這兩種疾病最常用的抗菌藥之一。

隨著氟苯尼考在豬細(xì)菌性疾病，尤其是HPS和APP控制中的大量廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性逐年上升，耐藥菌株流行[6]。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道重慶部分地區(qū)副豬嗜血桿菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率達(dá)到29%[7]，湖南部分地區(qū)胸膜肺炎放線桿菌對(duì)氟苯尼考的耐藥性也已達(dá)到20%[8]，給疾病的治療和控制帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，尋找合理的聯(lián)合用藥已成為控制耐藥菌感染和延長(zhǎng)現(xiàn)有抗生素使用壽命亟待解決的問(wèn)題。因此本研究篩選與氟苯尼考聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用的抗生素，為APP和HPS感染的治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

副豬嗜血桿菌SH0165株為血清5型的地方分離強(qiáng)毒株[9]，胸膜肺炎放線桿菌JL03株為血清3型的臨床分離株[10]，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物傳染病分室提供。兩種細(xì)菌均在添加8%胎牛血清和5‰NAD的TSA固體培養(yǎng)基或TSB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；四季青無(wú)菌胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，配制成1mg/m L的儲(chǔ)存濃度，過(guò)濾除菌備用。

氟苯尼考：江蘇恒盛藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)FB1503032；鹽酸多西環(huán)素：揚(yáng)州聯(lián)博藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)YD141001100；硫酸黏桿菌素：山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1411016；甲氧芐啶（TMP）：壽光富康制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)YR20140173。稱(chēng)取以上四種抗生素適量，溶于相應(yīng)量的溶劑中，使?jié)舛葹? 120μg/m L，過(guò)濾除菌，-20℃保存。

1.3 體外MIC的測(cè)定

按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）（M100-S19）推薦的肉湯微量稀釋法進(jìn)行。將待測(cè)菌株分別接種液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.0（相當(dāng)于108CFU/m L），用液體培養(yǎng)基校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?，將菌液稀釋?07CFU/m L，備用；在96孔板中TSB培養(yǎng)基（含血清和NAD），在第一孔加入適當(dāng)體積的抗生素儲(chǔ)存液，后續(xù)孔進(jìn)行2倍梯度倍比稀釋?zhuān)粚⒅跋♂尯玫木杭尤胛⒖装逯?，使菌液終濃度達(dá)到105CFU/m L，每孔總體積為100μL。同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照，37℃條件下，APP培養(yǎng)16～20小時(shí)，HPS培養(yǎng)48小時(shí)，讀取抗生素對(duì)菌株的最小抑菌濃度即為MIC，每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，重復(fù)三次。

1.4 聯(lián)合用藥的體外抑菌試驗(yàn)

用棋盤(pán)法測(cè)定氟苯尼考與多西環(huán)素、黏桿菌素和TMP聯(lián)合的體外抑菌活性。將儲(chǔ)存濃度的抗生素配制成2.5、5、10、20、40倍MIC的濃度，參照MIC測(cè)定的方法，分別將兩種抗生素加入到同一個(gè)孔中，使各孔中的藥物最終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4倍MIC的濃度。另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。重復(fù)棋盤(pán)試驗(yàn)3次，每次3個(gè)重復(fù)。氟苯尼考與其他抗菌劑的聯(lián)合用藥試驗(yàn)以抑菌濃度指數(shù)（Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）作為判斷依據(jù)[11,12]。FIC的計(jì)算公式為：

FIC=甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)的MIC

當(dāng)FIC≤0.75時(shí)判為協(xié)同作用，1.00≥FIC＞0.75時(shí)判為相加作用，2.00≥FIC＞1.00時(shí)判為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2.00時(shí)判為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 抗生素單用MIC的測(cè)定結(jié)果

氟苯尼考、多西環(huán)素和黏桿菌素單用對(duì)副豬嗜血桿菌SH0165株和胸膜肺炎放線桿菌JL03株的抑菌MIC較小，均≤1μg/m L，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）的判定標(biāo)準(zhǔn)均為敏感。而TMP對(duì)副豬嗜血桿菌SH0165株的MIC為8μg/m L，屬于耐藥；對(duì)胸膜肺炎放線桿菌JL03株的MIC為0.25μg/m L，屬敏感，詳見(jiàn)表1。

2.2 抗生素聯(lián)用MIC的測(cè)定結(jié)果

采用棋盤(pán)法對(duì)兩種藥物聯(lián)合使用的體外最小抑菌濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。其中氟苯尼考和多西環(huán)素聯(lián)用后，對(duì)副豬嗜血桿菌SH0165株和胸膜肺炎放線桿菌JL03株的FIC=0.75，均呈現(xiàn)協(xié)同作用；而和TMP聯(lián)用后均呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用（FIC=1.5）。氟苯尼考和黏桿菌素聯(lián)用后，對(duì)副豬嗜血桿菌SH0165株呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用（FIC=2），對(duì)胸膜肺炎防線桿菌JLl03株呈現(xiàn)協(xié)同作用（FIC=0.75）。

表1 幾種抗生素單用的MIC測(cè)定結(jié)果 （μg/m L）

表2 氟苯尼考聯(lián)合其他藥物對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌效果 （μg/m L）

3 討論

最近十余年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)氟苯尼考開(kāi)展了大量的體外抑菌試驗(yàn)，證實(shí)其對(duì)胸膜肺炎防線桿菌、豬鏈球菌高度敏感[2]。同時(shí)，大量臨床試驗(yàn)表明，氟苯尼考治療鏈球菌病和胸膜肺炎的效果也比較顯著，在臨床癥狀、肺病變計(jì)分、日增重、血清學(xué)試驗(yàn)等指標(biāo)上，效果優(yōu)于其他抗菌藥[13]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考對(duì)傳染性胸膜肺炎的敏感性仍高于其他抗生素[14]。但隨著抗菌劑的大量使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，目前在部分豬場(chǎng)使用氟苯尼考等常用抗菌劑對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌感染的治療效果下降；因此，篩選具有協(xié)同作用或累加作用的抗生素組合，可以為臨床確定合理的給藥方案，提高療效和治愈率，還可部分解決耐藥菌株引起的感染，并防止耐藥菌株的出現(xiàn)，延長(zhǎng)抗生素的使用壽命，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究采用臨床控制呼吸道疾病的最主要的抗生素——氟苯尼考與其他常用抗生素聯(lián)合使用，測(cè)定FIC判斷是否具有協(xié)同作用。經(jīng)過(guò)聯(lián)合用藥測(cè)定和計(jì)算，氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌均具有很好的協(xié)同作用，與報(bào)道的氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對(duì)愛(ài)德華氏菌的抑菌效果呈現(xiàn)相加作用[15]和對(duì)豬源大腸桿菌的抑菌效果呈現(xiàn)協(xié)同或相加作用、縮小耐藥突變選擇窗[16]等結(jié)果相一致；氟苯尼考與黏桿菌素聯(lián)合使用對(duì)胸膜肺炎放線桿菌也同時(shí)具有協(xié)同作用，與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)豬大腸桿菌和鏈球菌具有協(xié)同作用[17]的結(jié)果相似，而對(duì)副豬嗜血桿菌卻呈現(xiàn)無(wú)關(guān)作用。因此，以上結(jié)果提示在體內(nèi)治療由于副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌引起的感染時(shí)，兩藥聯(lián)用或可減少氟苯尼考及多西環(huán)素的用量，或提高療效。

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，氟苯尼考和多西環(huán)素聯(lián)合用藥，對(duì)副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌配伍比例均為4∶1，可呈協(xié)同作用。氟苯尼考和黏桿菌素聯(lián)合用藥，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的抑菌配伍比例為4∶1，也具有協(xié)同作用。在臨床上按照此比例進(jìn)行合理組合用藥，可以很大程度上節(jié)約抗生素的使用量或大大提高療效，節(jié)約治療費(fèi)用和成本；或者在同樣使用劑量和濃度下更為有效殺滅和抑制耐藥菌的感染。這對(duì)氟苯尼考等的實(shí)際應(yīng)用、抗生素的聯(lián)合使用或者復(fù)方制劑的研制具有重要意義。

致謝：

本試驗(yàn)所用的副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌為周銳教授提供，試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和獸醫(yī)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室完成，在此一并表示感謝。

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S858.28

A

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2015-10-19