切口平移法制備DNA探針的原理

張大海

摘 要 DNA探針可用于DNA分子的定量分析、特異識別，對分子生物學(xué)、基因組學(xué)、病毒學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的意義，切口平移法是制備DNA探針的常見方法。介紹了該方法的關(guān)鍵酶和DNA探針的原理。

關(guān)鍵詞 切口平移法 DNA探針

中圖分類號 Q-49 文獻標志碼 E

2015年的江蘇高考生物試題的33題涉及切口平移法制備DNA探針，但這一知識點高中生物教材中沒有提及。題干中的描述也較為簡單，雖然題中配有相關(guān)圖示，但學(xué)生仍很難理解。下面以大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ為例，說明切口平移法制備DNA探針的原理，以解釋學(xué)生的疑問。

1 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ功能的復(fù)雜性

DNA聚合酶Ⅰ是Kornberg從大腸桿菌中分離出第一種DNA聚合酶，該酶相對分子質(zhì)量為103 000，由一條單一的多肽鏈組成，據(jù)測定，每個大腸桿菌細胞中約有400個DNA聚合酶Ⅰ的分子。

當有底物和模板存在時，DNA聚合酶Ⅰ可催化脫氧核苷酸逐個加到具有3′-OH末端的多核苷酸鏈上。與其他種類的DNA聚合酶一樣，DNA聚合酶Ⅰ只能在已有的核酸鏈上延伸DNA鏈。

值得注意的是DNA聚合酶Ⅰ是一種多功能酶，可以催化以下的反應(yīng)：

① 通過核苷酸聚合反應(yīng)，使DNA鏈沿5′→3′方向延長，即具有DNA聚合酶活性；

② 由3′端水解DNA鏈，即具有3′→5′核酸外切活性；

③ 由5′端水解DNA鏈，即具有5′→3′核酸外切活性。

因此，DNA聚合酶Ⅰ實際上兼有聚合酶、3′→5′核酸外切酶和5′→3′核酸外切酶活性。

若用蛋白酶對DNA聚合酶Ⅰ進行有限水解，可以得到相對分子質(zhì)量為68 000和35 000的2個片段，其中68 000片段稱為Klenow片段。聚合酶活性區(qū)域和3′→5′核酸外切酶活性區(qū)域相鄰，位于其中（圖1）。DNA鏈沿5′→3′方向延長和3′→5′核酸外切幾乎是完全相反的反應(yīng)過程，催化這兩個過程的活性區(qū)域緊密相鄰，表明兩者之間有著重要的內(nèi)在聯(lián)系。

X射線衍射研究揭示，Klenow片段的空間結(jié)構(gòu)中有2個明顯的裂隙，其中一個裂隙為雙鏈DNA的結(jié)合位點；另一裂隙為聚合反應(yīng)的催化位點以及單鏈模板的結(jié)構(gòu)位點。3′→5′核酸外切酶位點十分靠近聚合酶位點，合成鏈的3′端可在其間擺動（圖2）。

當模板DNA落入DNA聚合酶Ⅰ的拇指結(jié)構(gòu)和指形結(jié)構(gòu)間的凹槽時，引起構(gòu)象改變，從而使聚合酶能夠握住DNA分子。由于凹槽空間只允許底物與模板之間按堿基互補原則配對，非配對的堿基因凹槽空間不適合而不能進行聚合反應(yīng)，因此，酶對底物進行了一次配對專一性的核對。這一機制保證了新合成的鏈嚴格按模板鏈的互補堿基順序進行聚合。

雖然如此，錯配的堿基仍然會不可避免的出現(xiàn)，DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′核酸外切酶活性能夠切除單鏈DNA的3′末端核苷酸，而對雙鏈DNA則不起作用。因而，不能形成堿基對的錯配核苷酸可被該酶水解下來。也就是說，在正常配對的情況下，3′→5′外切酶活性不能作用于生長鏈；但一旦發(fā)生錯配堿基，聚合反應(yīng)立即停止，生長鏈的3′末端核苷酸，落入3′→5′外切酶位點，錯配的核苷酸即被除去，然后聚合反應(yīng)才能繼續(xù)進行。因此，3′→5′核酸外切酶活性可以被認為是聚合過程中的第二次核對。因此，DNA復(fù)制過程中，堿基配對就經(jīng)過雙重核對，即聚合酶的選擇作用和3′→5′核酸外切酶的校對作用。實驗表明，在無3′→5′核酸外切酶校對功能時，DNA聚合酶Ⅰ摻入核苷酸的錯誤率為10-5，具有校對功能后錯誤率下降至5×10-7。

與此同時，DNA聚合酶Ⅰ還具有5′→3′核酸外切活性，只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，從5′末端水解下核苷酸或寡核苷酸。這一功能具有以下重要意義：DNA分子在紫外線照射時容易形成嘧啶二聚體，5′→3′核酸外切活性可切除嘧啶二聚體，以減少基本突變的概率；同時DNA半不連續(xù)合成中岡崎片段5′端RNA引物的切除，也有賴于這種外切活性。

2 切口平移法制備DNA探針的過程

DNA探針是利用同位素、生物素或熒光染料等標記的特定DNA片段，可用于DNA分子的定量分析、特異識別，對分子生物學(xué)、基因組學(xué)、病毒學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，具有十分重要的意義。根據(jù)是否使用放射性標記物，DNA探針可分為放射性標記探針和非放射性標記探針，江蘇高考試題中所涉及的熒光探針即屬于非放射性標記探針，較之傳統(tǒng)的放射性標記探針，有檢測快速、重復(fù)性好、用量少、無輻射等優(yōu)勢，近年來有逐漸取代放射性標記探針的趨勢。

使用切口平移法制備DNA探針的過程可大致分成以下幾個步驟：

① 使用DNA酶Ⅰ在DNA雙鏈上隨機切開若干切口，切口處分別形成3′和5′末端（圖3）。

② 利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性，在切口處按5′→3′方向切除單核苷酸；同時利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性，在切口處3′端加入底物中的單核苷酸，使脫氧核苷酸鏈得以延伸（圖4）。

③ 隨著反應(yīng)的進行，切口不斷按5′→3′的方向移動，底物中被標記的單核苷酸被摻入到DNA鏈中，直至被標記的DNA片段兩條鏈的3′端時完成標記（圖5）。

3 切口平移法制備DNA探針的釋疑

3.1 DNA酶Ⅰ不像限制性內(nèi)切酶那樣將DNA切斷的原因

限制性內(nèi)切酶作用于DNA分子時，能識別DNA分子中的限制性片段，并切開特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，最終將DNA分子切斷。而DNA酶Ⅰ同樣是切斷磷酸二酯鍵，但只是在DNA分子上留下切口而未將DNA分子切斷，其原因在于，限制酶的識別序列很短（大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)的限制酶的識別序列由4、5或8個核苷酸組成）。以EcoRⅠ為例，其識別序列為GAATTC，當其在識別序列的中心軸線（圖中虛線）兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生黏性末端，雖然在其中仍然存在氫鍵作用和堿基堆積力，但由于兩條鏈的切割位點之間只有4個堿基對，其作用不足以維持DNA分子的穩(wěn)定，因而被切斷。但是DNA酶Ⅰ作用于DNA分子時是隨機切開DNA分子中的磷酸二酯鍵，DNA兩條鏈上的切口的距離較遠，其間的堿基對間的氫鍵和堿基堆積力，足以維持DNA分子的穩(wěn)定，因而不會被切斷，而只是留下切口。

3.2 DNA酶Ⅰ作用后留下的多個切口是否會影響標記

DNA酶Ⅰ可以使DNA分子的兩條鏈上隨機出現(xiàn)多個切口，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，每個切口外均進行3′末端的聚合反應(yīng)和5′末端的外切反應(yīng)，相互之間無干擾，但每條鏈上最接近5′末端的切口上結(jié)合的DNA聚合酶Ⅰ，會將其他的聚合酶所形成的區(qū)域中的核苷酸逐一切除，并形成一條完整的脫氧核苷酸鏈，從而完成整個的標志過程。

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