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    細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展

    2015-09-10 20:53:53崔海英張雪婧趙呈婷等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:檢測技術(shù)

    崔海英+張雪婧+趙呈婷等

    摘要: 細(xì)菌生物膜是一種包裹在細(xì)胞外多聚物基質(zhì)中的、黏附于有生命或無生命物體表面的細(xì)菌群體,相對于游離狀態(tài)的細(xì)菌,生物膜狀態(tài)下的耐藥性更強(qiáng),給臨床治療帶來困難。近年來,細(xì)菌生物膜的研究得到了迅速發(fā)展,細(xì)菌生物膜的檢測技術(shù)及清除方法日益完善且效果更佳。本文介紹了細(xì)菌生物膜研究的最新進(jìn)展,包括細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測技術(shù)、清除方法,并對生物膜的清除進(jìn)行了展望,為研究細(xì)菌耐藥性、控制生物膜感染提供了理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞: 細(xì)菌生物膜;耐藥機(jī)理;檢測技術(shù);清除方法

    中圖分類號: Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A[HK]

    文章編號:1002-1302(2015)08-0011-04[HS)]

    抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng),給臨床治療帶來困難。美國疾病控制與預(yù)防中心的專家研究表明,65%~80%的人類細(xì)菌感染與生物膜相關(guān),50%的院內(nèi)感染與醫(yī)療器械裝置上的生物膜相關(guān)聯(lián) [1-2]。在惰性表面形成生物膜后,生物膜保護(hù)細(xì)菌免受宿主的獲得性免疫應(yīng)答以及吞噬細(xì)胞的捕食,使其耐藥性提高10~1 000倍 [3],引起了人們極大的關(guān)注。

    細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是指細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境,黏附于有生命或無生命物體表面后,被細(xì)菌胞外自身產(chǎn)生的多聚物基質(zhì)包裹的有組織的細(xì)菌群體 [4-5]。細(xì)菌生物膜中水分含量可高達(dá)97%;除了水和細(xì)菌外,生物膜中還含有蛋白質(zhì)、多糖、肽聚糖、DNA、脂、磷脂等物質(zhì) [6]。本文就細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,涉及細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理、檢測技術(shù)以及清除方法,并對細(xì)菌生物膜清除方法的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

    1 細(xì)菌生物膜的耐藥機(jī)理

    1.1 細(xì)菌生物膜的屏障作用

    細(xì)菌吸附在惰性表面后,自身會產(chǎn)生大量的多糖、脂類等多聚物包裹在細(xì)菌外,從而形成了1層天然的屏障,這是生物膜的顯著特點(diǎn)之一,這種特點(diǎn)可以防止抗生素嵌入在細(xì)菌外壁上。革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌)比革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜外多1層細(xì)胞外膜(多聚糖),就可以有效阻止抗生素的進(jìn)入,或降低進(jìn)入藥物的殺菌性。Suci等利用紅外光譜研究表明,抗生素環(huán)丙沙星滲透進(jìn)生物膜的速度與滲透進(jìn)游離細(xì)菌內(nèi)部的速度相比有明顯降低,這是由于部分環(huán)丙沙星被結(jié)合到生物膜組分中 [7]。還有研究表明,胞外多糖是帶負(fù)電荷的,會吸收多肽鏈中帶正電荷的氨基側(cè)鏈,形成1道屏障,從而阻礙親水性的抗生素滲透入菌體發(fā)揮殺菌作用,使抗生素的殺菌能力顯著降低 [8]。

    但是現(xiàn)在有越來越多的試驗(yàn)證明,屏障作用不是生物膜的主要耐藥機(jī)理。Walters等研究表明,氟喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星是能夠穿透銅綠假單胞菌生物膜的 [9]。Anderl等發(fā)現(xiàn),盡管環(huán)丙沙星、氨芐青霉素可以穿透整個有β-內(nèi)酰胺酶突變體的肺炎克雷伯菌生物膜,但是這個突變體仍然耐氨芐青霉素 [10]。

    1.2 細(xì)菌生物膜中表型的表達(dá)

    一些細(xì)菌為了適應(yīng)環(huán)境的改變,特定的基因表達(dá)能夠使它們具有耐藥性。生物膜細(xì)菌聚集、黏附以后,為了適應(yīng)新的生存環(huán)境,特定的基因表達(dá)發(fā)生變化,使生物學(xué)行為發(fā)生改變,這稱為生物膜表型。細(xì)菌特有的表型能夠激發(fā)出生物膜的耐藥機(jī)理,Beaudoin等發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌ndvB基因與細(xì)胞外多聚糖的形成有關(guān) [11],如果表達(dá)水平上發(fā)生了改變,多聚糖的形成會發(fā)生變化,就會導(dǎo)致抗生素遠(yuǎn)離生物膜外特定的靶細(xì)胞或者與其發(fā)生螯合反應(yīng),從而降低了抗生素的作用,提高了生物膜的耐藥性。

    另外,也有研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌擁有編碼群體感應(yīng)的2個重要調(diào)節(jié)基因 LuxS、pga操縱子,在生物膜中表達(dá)有所增強(qiáng),會引起信號合成酶、β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶增多,使初始黏附和生物膜成熟效果增加,導(dǎo)致生物膜中的菌株表現(xiàn)出強(qiáng)的耐藥性。人工去除細(xì)菌中的luxS基因,會使所培養(yǎng)的浮游菌株耐藥性降低,而生物膜菌株耐藥性下降不是很明顯,表明耐藥性并不是單一的耐藥性基因所控制的 [12]。

    1.3 細(xì)菌生物膜的抗生素外排泵系統(tǒng)

    抗生素外排泵系統(tǒng)就是指細(xì)菌能夠產(chǎn)生外排系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)胞生物膜的抗生素排出體外,這是細(xì)菌自我保護(hù)的一種手段。自從1980年McMurray等首次提出主動外排系統(tǒng)是大腸桿菌對四環(huán)素的基本耐藥機(jī)理之后,主動外排系統(tǒng)得到了廣泛深入的研究。Mah認(rèn)為,銅綠假單胞菌基因組中有12個RND外排泵編碼 [13],主要起耐藥作用的是MexAB-OprM、MexCD-OprJ [14]。Gillis等也發(fā)現(xiàn),MexCD-OprJ、MexXY基因是銅綠假單胞菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿齊霉素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理 [15]。此外,突變增加MexAB-OprM外排泵的活性也已被證明是銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類藥物的主要抗性機(jī)理 [16]。

    國內(nèi)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),AdeABC外排泵是鮑氏不動桿菌的主要外排系統(tǒng),其過度表達(dá)可增加對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性;外排系統(tǒng)adeIJK的過度表達(dá)與鮑氏不動桿菌對四環(huán)素、氟喹諾酮類、克林霉素類、β-內(nèi)酰胺類等抗菌藥物的耐藥性也有所相關(guān) [17-18]。

    1.4 細(xì)菌密度感應(yīng)效應(yīng)(QS)

    QS系統(tǒng)是細(xì)菌間信息傳遞的一種機(jī)制,通過監(jiān)測其群體的細(xì)胞密度來調(diào)節(jié)其特定的基因表達(dá)。此外,QS信號分子的分子量低、化學(xué)種類廣泛,包括:?;呓z氨酸內(nèi)酯、呋喃硼酸酯、順式不飽和脂肪酸和肽 [19]。Cristina等研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌的群體效應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)稱為Agr系統(tǒng),包括膜結(jié)合蛋白(AgrB)、QS肽(AgrD)、雙組分信號傳輸系統(tǒng)[包括傳感器組氨酸激酶(AGrC)、響應(yīng)調(diào)節(jié)器(AGrA)] [20]。在銅綠假單胞菌中,QS系統(tǒng)由2個信號系統(tǒng)(LasI/LasR、RhlI/RhlR)組成,這2個信號系統(tǒng)又分別產(chǎn)生特征性的N-?;呓z氨酸內(nèi)酯信號分子、N-丁?;?L-高絲氨酸內(nèi)酯(BHL)、N-(3-氧代十二酰)-L-高絲氨酸內(nèi)酯(OdDHL),一起應(yīng)對生存環(huán)境的改變。此外,這2個信號系統(tǒng)都由LuxI合成酶組成,并負(fù)責(zé)AHL的合成,AHL是細(xì)菌QS系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子,調(diào)節(jié)環(huán)境變化 [21]。此外,賈寧等研究表明,AgrD、RNAⅢ系統(tǒng)在提高紅霉素耐藥性的過程中起著重要作用 [22]。

    1.5 其他機(jī)理

    細(xì)菌生物膜耐藥是多種機(jī)理共同參與的結(jié)果,除以上幾種機(jī)理之外,還有營養(yǎng)及氧氣的限制 [23]、分泌抗生素水解酶 [24]、免疫防御體制、普遍應(yīng)激反應(yīng) [25-26]等機(jī)制也可影響生物膜的耐藥性。

    2 細(xì)菌生物膜的檢測技術(shù)

    2.1 染色法

    染色法就是利用生物膜內(nèi)的物質(zhì)能夠與某些染料結(jié)合的性質(zhì),通過染色的方法對細(xì)菌的生物膜進(jìn)行定量,最常見的染色劑為結(jié)晶紫、剛果紅、銀鹽。結(jié)晶紫法的操作為:先用1%的結(jié)晶紫溶液浸潤生物膜生成的表面,靜置30 min后,用清水洗去多余的染料,將剩余的水吸干并除去后,用乙醇或乙酸溶液溶解附著于生物膜上的染料,所得有色溶液用分光光度計或酶標(biāo)儀測定590 nm處的吸光度 [27]。這種方法簡便快捷,適用于試管法及96孔板法形成的生物膜的檢測。王業(yè)梅等用銀染法動態(tài)觀察了銅綠假單胞菌生物被膜的形成及形成后的生物被膜,結(jié)果初步顯示了生物被膜形成的過程及形成后清晰完整的生物被膜 [28]。銀染法的優(yōu)點(diǎn)是試劑價格低廉,同時易于試驗(yàn)操作,試驗(yàn)條件要求不高,并且敏感性較好,普通的微生物實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行操作。

    2.2 熒光法

    熒光染色劑主要是由SYTO9、碘化丙啶構(gòu)成,SYTO9能夠穿透所有的細(xì)菌膜,使細(xì)胞染為綠色;而碘化丙啶只能穿透受損細(xì)胞的細(xì)胞膜,這樣2個物質(zhì)結(jié)合反應(yīng),使細(xì)胞染為紅色 [29]。這樣就使觀察細(xì)菌生物膜有了選擇性:通過觀察不同顏色的細(xì)胞,能夠區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞;另外用熒光標(biāo)記的抗體或凝集素更可以特異性地識別生物膜中的某些成分而使其顯色 [30]。目前出現(xiàn)了一種新的熒光法——肽核酸(PNA)探針熒光原位雜交技術(shù),能夠檢測和鑒定慢性傷口生物膜中的細(xì)菌種類及細(xì)菌的分布情況 [31]。PNA探針比DNA探針有更高的疏水性,使其更容易穿透疏水性的細(xì)胞壁,從而進(jìn)入靶細(xì)胞的內(nèi)部。肽核酸熒光原位雜交(PNA FISH)技術(shù)作為一種準(zhǔn)確、快速的檢測技術(shù),對實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置條件要求也不高,易于操作。

    2.3 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)

    激光共聚焦顯微鏡擁有電鏡和普通光鏡均沒有的優(yōu)勢,被認(rèn)為是目前研究細(xì)菌較為理想的方法。該方法可以對細(xì)菌及生物膜中各種成分進(jìn)行不同顏色的熒光染色,且能夠避免對細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的破壞;能夠?qū)?xì)菌及其生物膜進(jìn)行無損傷的連續(xù)斷層掃描,并且所得生物膜的各種平面圖像可以進(jìn)行3D圖像重建。同時使用激光共聚焦顯微鏡,我們可以對生物膜的各種指標(biāo)如生物膜的厚度、比表面積、各種熒光的強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行量化,能夠較為方便地得到細(xì)菌形成生物膜的動態(tài)過程中的各種量化數(shù)據(jù) [32]。激光共聚焦顯微鏡不僅提高了分辨率,顯著改變了視野的深度和廣度,并且其所觀察的樣品無須進(jìn)行脫水等處理,而且能夠最大程度地保持觀察對象的完整性,從而使結(jié)果更接近真實(shí)情況。宋菲等采用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對細(xì)菌及生物膜的菌體和多糖成分分別標(biāo)記,從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌及其生物膜形成過程中的多糖形成及細(xì)菌分布情況的觀察,并且這種方法可以在操作過程中大大降低生物膜的減少與缺損程度 [33]。

    2.4 原子力顯微鏡(AFM)

    原子力顯微鏡是利用微懸臂感受和放大懸臂上尖細(xì)探針與受測樣品原子之間的作用力而達(dá)到檢測的目的,具有原子級的分辨率。由于原子力顯微鏡既可以觀察導(dǎo)體,又可以觀察非導(dǎo)體,從而彌補(bǔ)了電鏡的不足 [34]。與電子顯微鏡相比,原子力顯微鏡有很多優(yōu)勢:樣品制備簡便,樣品導(dǎo)電與否都適用于該儀器;操作環(huán)境不受限制,既可以在真空,又可以在大氣中進(jìn)行;可以對所測區(qū)域的面粗糙度值進(jìn)行統(tǒng)計等 [35]。Abe等利用原子力顯微鏡來測量飲用水中的生物膜;用原子力顯微鏡來測量機(jī)械剪應(yīng)力,從而估計生物膜的糾纏率 [36]。Ansari等利用原子顯微鏡觀察棗蜜對白色念珠菌的細(xì)胞膜,結(jié)果表明棗蜜可以影響白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài)、減少其形成生物膜的厚度 [37]。

    3 清除生物膜的方法

    目前細(xì)菌生物膜已成為人們關(guān)注的話題,而清除細(xì)菌生物膜的方法也已成為人們研究的熱點(diǎn),主要有以下幾點(diǎn)。

    3.1 物理方法

    清除細(xì)菌生物膜的物理方法主要有機(jī)械法、超聲波法、電擊法等。機(jī)械法為最原始的方法,但也是最有效的方法。

    例如每天的刷牙活動,就是通過不斷地摩擦而去除牙菌斑;用眼鏡布擦眼鏡也是類似的機(jī)械方法。超聲波可以通過空穴和起泡作用來消除生物膜 [38]。朱秀菊研究發(fā)現(xiàn),高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)能在一定程度上殺滅銅綠假單胞菌并且破壞其生物膜結(jié)構(gòu) [39]。HIFU的生物學(xué)效應(yīng)主要是熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng),而且高強(qiáng)度者殺菌作用強(qiáng)。同樣,Wirthlin等也發(fā)現(xiàn),電擊能夠減少牙模型上污染的細(xì)菌數(shù)量 [40]。Kang等還發(fā)現(xiàn),可以通過高壓的CO2氣體的絕熱膨脹,使1個噴嘴中產(chǎn)生的氣溶膠噴射到在硅芯片上已生長了24h的大腸桿菌的生物膜上,可以明顯清除生物膜 [41]。

    3.2 化學(xué)方法

    化學(xué)方法就是指通過某些化合物來清除生物膜,是最常用的清除生物膜的方法。一般用的有酶、活性肽、精油及其他化學(xué)試劑。

    Son等研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞壁降解酶SAL-2對金黃色葡萄球菌有特異性裂解活性,也包括耐甲氧西林菌株,并且約 1 μg/mL 的最小抑制濃度就可以降解生物膜 [42]。Borges等表明,異硫氰酸酯可以降低大腸桿菌、銅綠假單胞菌的黏附能力,并在生物膜上呈現(xiàn)出較高的電位,以減小由革蘭氏陰性細(xì)菌形成的生物膜質(zhì)量 [43],可以使大腸桿菌降低60%的生物膜活性。五倍子不同提取組分對5種口腔浮游細(xì)菌均有良好的抑制作用,其中五倍子多酚性化合物、五倍子B對5種口腔生物膜細(xì)菌的抑制作用最好,其次為五倍子C、五倍子D [44]。

    乳鐵蛋白對銅綠假單胞菌有殺菌活性,同時還能抑制其生物被膜的形成,其作用與濃度呈正相關(guān);FeCl3促進(jìn)銅綠假單胞菌生長和生物被膜的形成;乳鐵蛋白與鐵結(jié)合后,對其生物被膜的形成有抑制作用 [45]。納米銀離子對表皮葡萄球菌的生物膜形成和形態(tài)、結(jié)構(gòu)的完整性有抑制作用,但是隨著時間的推移,其抗菌作用逐漸減弱。高濃度組較低濃度組抗菌效果更加明顯,持續(xù)時間更長 [46]。

    3.3 協(xié)同方法

    所謂協(xié)同方法,就是將物理方法與化學(xué)方法或物理方法或其他的一些方法所結(jié)合起來的方法。Oulahal-Lagsir等通過嘗試將超聲波、蛋白水解酶、糖酵解酶制劑互相配合來清除生物膜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間具有協(xié)同效果,可以清除61%~96%的細(xì)菌生物膜,效果是單獨(dú)超聲波處理(30%)的2~3倍 [47]。

    除此之外,Pechaud等將酶和機(jī)械(剪切應(yīng)力)一起應(yīng)用來處理異養(yǎng)需氧生物膜,發(fā)現(xiàn)最佳剪切應(yīng)力為2.5 Pa,以便最大限度地使生物膜脫落,同時避免由于機(jī)械處理而出現(xiàn)壓縮現(xiàn)象 [48]。這樣協(xié)同處理比單獨(dú)酶處理增加了80%的生物膜去除量(COD),并且能夠除去基底層的生物膜。

    國內(nèi)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),低頻超聲、環(huán)丙沙星單獨(dú)作用對銅綠假單胞菌的生物膜無殺菌作用;低頻超聲聯(lián)合環(huán)丙沙星后,對生物膜有很好的殺菌作用,而且低頻超聲對銅綠假單胞菌的生物膜結(jié)構(gòu)無影響,聯(lián)合環(huán)丙沙星后,能破壞生物膜的結(jié)構(gòu) [49]。

    4 結(jié)論

    細(xì)菌生物膜是細(xì)菌為了適應(yīng)新的生存環(huán)境而存在的,有很強(qiáng)的耐藥性。對細(xì)菌生物膜耐藥機(jī)制的了解,有利于更合理地選擇抗生素,有效地控制好臨床感染。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,新的理論不斷被提出,我們有理由相信,將來可以很好地解決細(xì)菌生物膜這一問題。清除生物膜的發(fā)展趨勢表現(xiàn)為:(1)我國資源豐富,今后應(yīng)更深入地探索一些天然活性物質(zhì)來清除生物膜;(2)生物方法目前還很少,可以探索一些如噬菌體等新的生物方法來抑制生物膜的生長;(3)目前微膠囊比較新穎,可以利用微膠囊定向靶位和控制釋放等優(yōu)點(diǎn)來清除生物膜。

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