10株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的篩選及鑒定

張艾艾　潘建剛　張超君等

摘要： 以包頭當(dāng)?shù)鼐沼蟾H土為材料，篩選到10株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌，其中芽孢桿菌的產(chǎn)酶活性相對(duì)較高。對(duì)部分菌株的鑒定結(jié)果表明，產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌分屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria），它們分別是短桿菌（Brevibacterium sp ）（A1）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） （A3）、多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa） （A6、A8）、桿菌屬（Bacillus sp ）（A7）。目前關(guān)于短桿菌屬、多黏類(lèi)芽孢桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌具有產(chǎn)菊粉酶能力的報(bào)道較少見(jiàn)。

關(guān)鍵詞： 菊粉酶；細(xì)菌；篩選；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： Q939 9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0360-03

菊粉酶（inulinase）是糖基水解酶 32 家族（glycosyl hydrolases family 32）的一員，又稱(chēng)β-2，1-D-果聚糖酶，它能特異地作用于β-2，1-D-果聚糖果糖苷鍵 [1-4]。根據(jù)其作用于底物的方式不同，又可分為內(nèi)切菊粉酶（endoinulinase，EC 3 2 1 7） 和外切菊粉酶（exoinulinase，EC 3 2 1 80），目前該酶被廣泛用于菊芋制備低聚果糖的工業(yè)生產(chǎn)，這主要是因?yàn)榫沼蟾缓仗?，而菊糖是由D-呋喃果糖分子經(jīng)β-2，1糖苷鍵聚合而成的聚合度較高的直鏈多糖，在菊粉酶的作用下，它可以從內(nèi)部和末端水解自身的β-2，1糖苷鍵，從而降解為低聚果糖 [5-8]。而微生物由于來(lái)源廣泛，種類(lèi)多，它已經(jīng)成為菊粉酶篩選的良好來(lái)源，但是迄今為止，在工業(yè)上還是很缺乏具有高產(chǎn)酶活性的功能菌株。因此，如何篩選獲得具有高產(chǎn)菊粉酶活性的目的菌株已經(jīng)成為眾多研究者的關(guān)注焦點(diǎn) [9-15]。這其中又以產(chǎn)菊粉酶真菌的研究居多，而對(duì)于細(xì)菌的研究較少。因此，本研究以?xún)?nèi)蒙古包頭當(dāng)?shù)鼐沼蠓N植的根際土壤為材料，定向篩選產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌，以期為菊芋制備低聚果糖提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 材料與試劑

菊芋根部土壤來(lái)源于包頭市東河區(qū)沙爾沁鎮(zhèn)。菊粉、瓊脂、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。3，5-二硝基水楊酸，購(gòu)自上海遠(yuǎn)帆助劑廠。冰醋酸、酒石酸鉀鈉、KCl、NaNO3、K2HPO4、（NH4）H2PO、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。上述藥品均為分析純。

DNS 試劑：取3，5-二硝基水楊酸3 15 g，加水500 mL，水浴至45 ℃，逐步加入100 mL 0 2 g/mL氫氧化鈉，然后加入酒石酸鉀鈉91 g、苯酚2 5 g、無(wú)水亞硝酸鈉 2 5 g，攪拌使之溶解，冷卻后定容至1 000 mL，貯存于棕色瓶中，放置 1 周后使用。

醋酸緩沖液（0 1 mol/L，pH值4 6）：準(zhǔn)確稱(chēng)取醋酸鈉 0 803 6 g，加少量蒸餾水溶解，再加入冰醋酸 0 59 mL，調(diào)節(jié)pH 值至4 6，加蒸餾水定容至200 mL。

1 2 培養(yǎng)基配制

富集培養(yǎng)基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水 1 000 mL。初篩培養(yǎng)基：菊粉30 g，KCl 0 5 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，F(xiàn)eSO4 0 01 g，K2HPO4 1 g，蒸餾水 1 000 mL，瓊脂15 g。復(fù)篩培養(yǎng)基（同發(fā)酵培養(yǎng)基）：菊粉20 g，蛋白胨10 g，（NH4）2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaNO3 5 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂15 g（發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)）。 斜面保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯 20 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15～20 g，pH值自然。

1 3 菌株篩選

富集培養(yǎng)：取菊芋根際土5 g，放入100 mL無(wú)菌水中，170 r/min振蕩1 h得懸浮液，將1 mL搖勻的懸浮液加入含有50 mL富集培養(yǎng)液的三角瓶中，37 ℃下170 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。

初篩：將經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)的菌液用無(wú)菌水稀釋為10 -1、10 -2、10 -3、10 -4等4個(gè)不同的濃度，分別吸取0 5 mL不同濃度土壤懸液于初篩培養(yǎng)基上，涂布均勻后，把培養(yǎng)皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，并觀察菌種的生長(zhǎng)情況，利用“透明圈法”對(duì)目的菌落進(jìn)行分離純化，最后對(duì)所得的菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)保藏。

復(fù)篩：利用純化與酶活性測(cè)定相結(jié)合的方法復(fù)篩產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌，先將純化的目的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d；然后選取生長(zhǎng)較快的菌株接入含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)72 h；發(fā)酵液3 500 r/min離心15 min，得到的上清液即為粗酶液；最后用DNS法測(cè)定粗酶液酶活性，從中獲得產(chǎn)酶活性較高的菌株。

1 4 酶活性的測(cè)定

1 4 1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 試驗(yàn)方案見(jiàn)表1，將各試管沸水浴7 min，顯色后快速冷卻，之后用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后在550 nm下測(cè)吸光度，以果糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

1 4 2 酶活性的測(cè)定 菊粉酶活性單位定義 [16]：反應(yīng)體系中1 min轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生 1 μmol 還原糖所需的酶量即為1個(gè)活性單位（U/mL）。酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]，略有改動(dòng)。向0 5 mL粗酶液中加入2 5 mL 1%菊糖（醋酸緩沖液配制），37 ℃ 反應(yīng)20 min，沸水滅活10 min，加入DNS 2 mL，沸水浴中7 min顯色，快速冷卻后加5 mL蒸餾水定容到10 mL，以去離子水為空白對(duì)照，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)吸光度。設(shè)3次重復(fù)，取平均值。endprint

1 4 3 酶活性的計(jì)算 按下面的公示來(lái)計(jì)算單位酶活性 [15]：酶活性=D·n·1 000/（k·t）。式中：n為稀釋倍數(shù)；k為曲線斜率；t為反應(yīng)時(shí)間（s）。

1 5 產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的16S rRNA分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用菌落PCR技術(shù)擴(kuò)增所得目的菌株的16S rRNA序列，引物選用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）， 具體方法參考文獻(xiàn)[18]。然后利用Blast程序?qū)ふ褿enBank中與各目的序列同源性最高的序列作為參考，最后用ClustalX 1 81軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，利用MEGA 4軟件以Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析 （采樣量1 000次），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) [18]。

2 結(jié)果與分析

2 1 產(chǎn)菊粉酶菌株產(chǎn)酶活性測(cè)定

由圖2可見(jiàn)，10株產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌的產(chǎn)酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈規(guī)律性變化，除菌株A1、A4外，其他菌株的產(chǎn)酶活性都是第1天最高，此后呈下降趨勢(shì)；而菌株A1、A4的產(chǎn)酶活性以第2天最高，此后開(kāi)始下降。

酶活性的產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌，并對(duì)其中部分菌株加以鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，產(chǎn)菊粉酶細(xì)菌多為厚壁菌門(mén)，此外也包含放線菌門(mén)和變形菌門(mén)，且來(lái)自厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)的細(xì)菌可能具有較好的產(chǎn)菊粉酶活性，如彼爾姆短桿菌（A1）和芽孢桿菌（A7）要高于多黏類(lèi)芽孢桿菌（A6、A8），而變形菌門(mén)的細(xì)菌產(chǎn)菊粉酶活性則較差。

張揚(yáng)等曾篩選到一株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），而且該菌的產(chǎn)酶活性在培養(yǎng)2天后達(dá)到最高 [4]，這與本研究中的菌株A4產(chǎn)酶性能一致，因此A4也可能是巨大芽孢桿菌。Pandey等發(fā)現(xiàn)產(chǎn)菊粉酶的細(xì)菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、黃桿菌屬 （Staphylococcus）和埃希菌屬（Escherichia）等許多類(lèi)型 [19]，而本研究則發(fā)現(xiàn)，除上述細(xì)菌外，短桿菌屬（Brevibacterium sp ）、多黏類(lèi)芽孢桿菌（P polymyxa）和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）也具有產(chǎn)菊粉酶能力，只不過(guò)這3類(lèi)細(xì)菌產(chǎn)菊粉酶能力較弱。因此，本研究后續(xù)將關(guān)注利用紫外誘變、化學(xué)突變技術(shù)以及重離子誘變技術(shù)來(lái)獲取高產(chǎn)菊粉酶活性菌。

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