鉛脅迫對(duì)日本免疫相關(guān)指標(biāo)及組織蓄積的影響

唐瑤　杜丹丹　彭東生等

摘要： 將日本[XCZ67 tif，JZ]暴露于不同濃度（0、0 025、0 05、0 5、1 0、2 5、5 0 mg/L）醋酸鉛中，于處理后0、1、3、5、7、10、15、30 d 取血，測(cè)定其血清中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性及過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛含量；并于脅迫30 d測(cè)定鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢中的鉛含量，以研究鉛脅迫對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]免疫能力及組織蓄積的影響。結(jié)果表明，在鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性均呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，且中高濃度鉛脅迫對(duì)抗氧化酶活性的誘導(dǎo)速度比低濃度快。脅迫30 d，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組2種酶活性均顯著弱于對(duì)照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0 05）。0 025 mg/L組丙二醛含量無(wú)明顯變化，其他各試驗(yàn)組丙二醛含量呈2種變化趨勢(shì)，即0 05、0 5、1 0 mg/L組先升后降再升，2 5、5 0 mg/L組持續(xù)上升。脅迫15 d，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組丙二醛含量均顯著高于對(duì)照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（P<0 05）。鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累以鰓和肝胰腺較多，而卵和肌肉在5 0 mg/L鉛脅迫下仍僅有微量蓄積。鰓和肝胰腺中鉛含量與脅迫濃度之間存在顯著濃度效應(yīng)（P<0 05）。可將日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鰓、肝胰腺鉛含量的長(zhǎng)期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞： 鉛脅迫；日本[XCZ67 tif，JZ]；免疫指標(biāo)；組織蓄積

中圖分類號(hào)： X171 5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0336-04

近年來(lái)，由于工農(nóng)業(yè)廢水的大量排放導(dǎo)致的重金屬污染問(wèn)題日益突出，對(duì)生態(tài)環(huán)境安全、人類食品安全及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了較大威脅 [1-3]。鉛是常見(jiàn)的重金屬污染元素之一，其在人和動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積會(huì)引起慢性中毒、神經(jīng)機(jī)能紊亂、貧血甚至誘發(fā)癌癥 [4]。日本[XCZ67 tif，JZ]（Charybdis japonica）廣泛分布于我國(guó)各海區(qū)，營(yíng)底棲生活，為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的海水養(yǎng)殖蟹類 [5]。關(guān)于重金屬對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]的影響已有少量研究報(bào)道，如張紅霞等分析了重金屬離子對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響 [6]；王春琳等探討了硫酸銅蓄積對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]保護(hù)酶系統(tǒng)的影響 [7]；苗利軍等對(duì)秦皇島海域野生日本[XCZ67 tif，JZ]等9種海產(chǎn)品總汞含量進(jìn)行了檢測(cè) [8]。本試驗(yàn)研究了不同濃度鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]血清中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物——丙二醛含量的變化，并分析了主要器官中鉛的蓄積量，旨在探討鉛對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]的毒性作用，為養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控、海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)及相關(guān)毒理學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1 1 試驗(yàn)材料

日本[XCZ67 tif，JZ]于2013年10月購(gòu)自江蘇省連云港市高公島海濱，采用生態(tài)閉路循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)條件為：鹽度2 5%，pH值8 0，水溫15 ℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次鮮活貝類。選擇附肢完整、活性強(qiáng)者用于試驗(yàn)，甲長(zhǎng)為（516±0 28） cm，甲寬為（6 82±0 41） cm，體質(zhì)量為（7659±1764） g。

1 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鉛源采用醋酸鉛，為國(guó)產(chǎn)分析純。根據(jù)GB 11607—1989《漁業(yè) 水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》 （鉛濃度≤0 05 mg/L）以及海水通常的鉛污染濃度 [9]，醋酸鉛濃度設(shè)7組：對(duì)照組（0 ）、低濃度組（0 025、0 05 mg/L）、中濃度組（0 5、1 0 mg/L）和高濃度組（2 5、5 0 mg/L），每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)取27只蟹，飼養(yǎng)30 d。水溫、投餌、充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時(shí)相同，每天定時(shí)換水2次，每次更換水體的50%，并維持各組醋酸鉛質(zhì)量濃度。

1 3 試驗(yàn)方法

于試驗(yàn)后0、1、3、5、7、10、15、30 d隨機(jī)抽取3只/缸蟹采集血樣。用無(wú)菌注射器先吸取ACD抗凝劑 [10]1 mL，再由蟹第三步足基關(guān)節(jié)處按1 ∶ 1比例抽取血淋巴，充分混勻， 5 000 r/min 冷凍離心10 min，取上清液即為血清，-80 ℃冷凍保存。30 d采集血樣后，分別將各組標(biāo)本冰凍麻醉后置冰盤(pán)上解剖，取出肝胰腺、肌肉、卵巢、鰓，用預(yù)冷重蒸水（0～4 ℃）沖洗，濾紙吸干水分，-80 ℃保存。

超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性、丙二醛含量和酶液蛋白含量采用南京建成生化試劑盒及美國(guó)BioTek Snergy HT型酶標(biāo)儀測(cè)定。樣品中鉛含量采用日本島津AA6300型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

1 4 數(shù)據(jù)分析

所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 16 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因子方差分析（One-Way ANOVA），LSD多重比較和Duncans檢驗(yàn)，顯著水平設(shè)為α=0 05。

2 結(jié)果與分析

2 1 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性的影響

由圖1可見(jiàn)，在鉛脅迫下，各試驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性均呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)。脅迫1 d時(shí)，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性均受到顯著誘導(dǎo)（P<0 05），其中以1 0、2 5 mg/L脅迫對(duì)超氧化物歧化酶活性的誘導(dǎo)效果較強(qiáng)。在低濃度組（0 025、0 05 mg/L），超氧化物歧化酶活性隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，分別于處理后10 d和7 d達(dá)到最高，隨后呈減弱趨勢(shì)。中濃度組（0 5、1 0 mg/L）和高濃度組（2 5、5 0 mg/L）超氧化物歧化酶活性最高值分別出現(xiàn)于 處理后5、3 d，其后持續(xù)減弱。至脅迫后15 d，濃度≤1 0 mg/L 的試驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性仍顯著強(qiáng)于對(duì)照組，而高濃度組活性顯著減弱。脅迫30 d時(shí)，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組超氧化物歧化酶活性均顯著弱于對(duì)照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0 932，P<0 05）。endprint

2 2 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]過(guò)氧化氫酶活性的影響

脅迫1 d時(shí)，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性均顯著強(qiáng)于對(duì)照組（P<0 05），脅迫質(zhì)量濃度≥1 0 mg/L 各組增強(qiáng)幅度較大（圖2）?！? 0 mg/L各組過(guò)氧化氫酶活性于5 d時(shí)增至最強(qiáng)，隨后持續(xù)減弱。而低濃度組（0 025、0 05 mg/L）對(duì)過(guò)氧化氫酶活性誘導(dǎo)較慢，最高值分別出現(xiàn)于脅迫后10、7 d。脅迫30 d時(shí)，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組過(guò)氧化氫酶活性均顯著弱于對(duì)照組，且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0 920，P<0 05）。

2 3 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]丙二醛含量的影響

如圖3所示，除0 025 mg/L組丙二醛含量無(wú)顯著變化外，各試驗(yàn)組丙二醛含量呈2種變化趨勢(shì)：0 05、0 5、1 0 mg/L 組丙二醛含量先增強(qiáng)后減弱再增強(qiáng)，而高濃度2 5、5 0 mg/L）組丙二醛含量表現(xiàn)為持續(xù)上升。脅迫1 d，≥0 5 mg/L組丙二醛含量顯著高于對(duì)照組（P<0 05），以1 0 mg/L組上升幅度最大。0 05、0 5、1 0 mg/L組丙二醛含量于脅迫7 d時(shí)有所下降，隨后又持續(xù)上升。脅迫15 d時(shí)，除0 025 mg/L組外，各試驗(yàn)組丙二醛含量均顯著高于對(duì)照組（P<0 05），且與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)（r=0 918，P<0 05）。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組間丙二醛含量的差距逐漸增大，但組間規(guī)律未變。

2 4 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]組織蓄積量的影響

從表1可以看出，鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累以鰓最多，肝胰腺次之，而卵和肌肉即使在5 0 mg/L鉛脅迫下僅有微量的蓄積。對(duì)照組在未添加外源性鉛脅迫的條件下，仍能檢測(cè)出微量鉛。鰓和肝胰腺中鉛含量與脅迫濃度之間均存在顯著的濃度效應(yīng)（P<0 05）。

3 結(jié)論與討論

3 1 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]免疫指標(biāo)的影響

鉛是一種不能降解且廣泛存在的重金屬污染物，其在生物體內(nèi)的富集會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，導(dǎo)致抗病力下降甚至死亡 [11-12]。當(dāng)生物體受到鉛等重金屬污染物時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ O-2[KG- 2]· ），造成機(jī)體的氧化損傷如酶蛋白失活、DNA斷裂等 [13]。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶是防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，可聯(lián)合清除活性氧自由基，防止過(guò)多的活性氧積存對(duì)機(jī)體造成氧化損傷 [14]。目前對(duì)抗氧化酶作為生物體氧化脅迫和損傷的標(biāo)志物已進(jìn)行了大量研究，但大多集中于銅、鋅、鎘等重金屬 [15-16]，而關(guān)于鉛對(duì)海洋動(dòng)物免疫相關(guān)酶影響的報(bào)道相對(duì)較少。任虹等研究發(fā)現(xiàn) 5 0×10 -17～50×10 -10 mol/L鉛對(duì)扁玉螺（Neverita didyma）過(guò)氧化氫酶有微弱的激活作用 [17]。王凡等報(bào)道鉛脅迫下，牙鲆（Paralichthys olivaceus）過(guò)氧化氫酶活性變化表現(xiàn)為先抑制后增強(qiáng)再抑制 [18]。張紅霞等研究表明，鉛脅迫0 25 d時(shí)，日本[XCZ67 tif，JZ]血淋巴超氧化物歧化酶活性呈顯著激活狀態(tài)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，鉛濃度≥2 5 mg/L試驗(yàn)組9 d后超氧化物歧化酶活性均顯著弱于對(duì)照組，但未檢出過(guò)氧化氫酶活性 [6]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鉛脅迫對(duì)日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性呈現(xiàn)出明顯的“短期誘導(dǎo)、長(zhǎng)期抑制”的效應(yīng)，且高濃度（≥2 5 mg/L）鉛的誘導(dǎo)作用在脅迫早期迅速出現(xiàn)，低濃度（≤0 05 mg/L）鉛的誘導(dǎo)則需要相對(duì)較長(zhǎng)的暴露時(shí)間。鉛脅迫30 d，鉛濃度≥0 05 mg/L組2種酶活性均顯著弱于對(duì)照組，表明鉛的長(zhǎng)期脅迫使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力下降。

丙二醛是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)的游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子間交聯(lián)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷 [19]。Company等研究發(fā)現(xiàn)，貽貝（Bathymodiolus azoricus）暴露在0 9 μmol/L 鎘溶液里24 h后，鰓中丙二醛含量顯著升高 [15]。本試驗(yàn)中，鉛濃度≤1 0 mg/L組丙二醛含量先升后降再升，而高濃度脅迫組丙二醛含量持續(xù)上升，表明一定程度的鉛脅迫可使日本[XCZ67 tif，JZ]抗氧化能力提高，減少丙二醛的產(chǎn)生，而低濃度鉛長(zhǎng)期脅迫或高濃度短期脅迫會(huì)破壞抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體清除自由基能力降低，過(guò)多的活性氧使脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，丙二醛含量隨之增加。

本研究中，鉛脅迫30 d的日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性均與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，以前者相關(guān)系數(shù)較大，且過(guò)氧化氫酶活性對(duì)鉛脅迫的響應(yīng)比超氧化物歧化酶活性略有滯后，而脅迫15 d的丙二醛含量即與鉛脅迫質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)，可將日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的長(zhǎng)期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

3 2 鉛脅迫對(duì)日本[XCZ68 tif，JZ]組織蓄積的影響

與銅、鎘等重金屬相比，鉛更易被某些海洋生物所累積，成為當(dāng)前威脅海洋食品安全的主要因素之一 [20]。本研究中的對(duì)照組在未添加外源性鉛脅迫的條件下，仍檢測(cè)出微量鉛，其中鰓和肝胰腺中的鉛含量超過(guò)或接近GB 2762—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》標(biāo)準(zhǔn)（0 5 mg/kg）。

趙元鳳等將牙鲆暴露于鉛環(huán)境中，其體內(nèi)鉛的蓄積量從多到少依次為內(nèi)臟>鰓>肌肉 [21]；而王凡等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)鉛脅迫處理后的櫛孔扇貝（Chlamys farreri）體內(nèi)的鉛蓄積量從多到少依次為鰓>內(nèi)臟>肌肉 [22]。本試驗(yàn)中，鉛在日本[XCZ67 tif，JZ]體內(nèi)的積累規(guī)律與櫛孔扇貝一致。鰓作為呼吸器官，與水體直接接觸，鉛較易進(jìn)入鰓上皮中，造成鰓中鉛含量迅速上升；而肝胰腺為重要的消化腺，積極地進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝，同時(shí)也較易蓄積外源性重金屬。王蘭等以體腔注射法對(duì)中華絨螯蟹（Eriocheir siensises）給予鎘脅迫，1 周后鎘主要積累在肝胰腺和鰓中，而卵巢與肌肉幾乎沒(méi)有積累。其所采用的體腔注射法，使鰓未與鎘直接接觸，所以試驗(yàn)結(jié)果中肝胰腺的鎘含量多于鰓 [23]。本研究發(fā)現(xiàn)，即使在高濃度鉛脅迫下，日本[XCZ67 tif，JZ]卵和肌肉中仍僅有微量的蓄積，與前者報(bào)道規(guī)律相近。endprint

從本試驗(yàn)結(jié)果綜合來(lái)看，在GB 11607—1989《國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》上限水體（鉛濃度0 05 mg/L）中，日本[XCZ67 tif，JZ]超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性明顯減弱，且鰓和肝胰腺鉛含量超過(guò)了GB 2762—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》標(biāo)準(zhǔn)，這在養(yǎng)殖生產(chǎn)及水產(chǎn)品食用安全中不容忽視。高濃度鉛脅迫會(huì)造成日本[XCZ67 tif，JZ]免疫酶活性大幅減弱，可能會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖蟹的疾病暴發(fā)。可將日本[XCZ67 tif，JZ]血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量以及鰓、肝胰腺鉛含量的長(zhǎng)期變化作為鉛污染的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

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