多酶法提取榛蘑多糖及光譜研究

鄒東恢　郭宏文

摘要： 研究了多酶法提取榛蘑多糖的最佳條件并進(jìn)行光譜研究，通過單因素和正交試驗(yàn)確定了酶法提取榛蘑多糖的最佳工藝，即：粒度80目，料水比1 ∶ 20，酶作用溫度40 ℃，加酶（加酶總量為底物的1%）質(zhì)量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶）3 ∶ 1，pH值6 5，酶作用時(shí)間2 0 h；在此條件下多糖的提取率可達(dá)16 85%。紅外光譜分析表明榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

關(guān)鍵詞： 榛蘑多糖；多酶法提?。徽辉囼?yàn)；光譜分析

中圖分類號(hào)： R284 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0276-03

榛蘑多糖（AMP）是從榛蘑菌絲體、子實(shí)體和發(fā)酵產(chǎn)物中分離而來的，是一種能夠控制細(xì)胞的分裂分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的活性多糖，同時(shí)它還具有抗輻射、促進(jìn)造血、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用 [1-2]。此外，榛蘑多糖也具有一定的抗氧化能力，可以用于制備具有抗氧化活性的天然活性物質(zhì)。榛蘑多糖提取可以采用熱水、稀酸、稀堿作為浸提劑，也可采用微波法、超聲波法輔助提取，浸提法是提取榛蘑多糖的傳統(tǒng)方法，但時(shí)間長(zhǎng)、效率低、能耗大 [3]，多糖的提取率普遍不高。酶法提取多糖簡(jiǎn)單快捷、省時(shí)低耗，對(duì)榛蘑多糖的工業(yè)化提取及生產(chǎn)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1 1 原料處理

將市場(chǎng)上購買的榛蘑根部去除后，用清水清洗干凈，用剪刀將菌傘剪成適當(dāng)?shù)男K，放入真空干燥箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎，將粉碎后的榛蘑干粉依次通過20、40、60、80目的篩子，之后將各級(jí)的榛蘑粉放入潔凈干燥的燒杯中，并將其置于干燥箱中待用。

1 2 試劑與儀器

SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；離心機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；RH-Q型全溫振蕩器：江蘇省全壇市榮華儀器制造有限公司；722紫外分光光度計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Lambda-35紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)PE公司；木瓜蛋白酶：北京世紀(jì)時(shí)尚科貿(mào)有限公司；纖維素酶：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所使用的試劑均為分析純。

1 3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以測(cè)定的吸光度D作為縱坐標(biāo)，葡萄糖的質(zhì)量濃度C作為橫坐標(biāo)，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12 313 0x-0 029 1，相關(guān)系數(shù)為r=0 999 1。

1 4 酶法提取榛蘑多糖的方法

精確稱取80目的榛蘑粉2 g于錐形瓶中，按照一定的料水質(zhì)量比加入蒸餾水，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值，按照一定加酶比加入木瓜蛋白酶和纖維素酶（加酶總量為底物的1%），在恒溫振蕩器上振蕩一定時(shí)間，用100 ℃沸水鍋水浴10 min，滅酶，在冷卻至室溫之后，用 8 000 r/min 離心機(jī)離心10 min，取上清液，即得到酶提取多糖清液。

1 5 多糖總量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸比色法 [4]。硫酸-苯酚法是以硫酸、苯酚作為顯色劑，與榛蘑多糖發(fā)生顯色反應(yīng)，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，再通過已經(jīng)測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得榛蘑中的多糖含量。

1 6 蛋白質(zhì)去除方法

本試驗(yàn)采用Sevage法 [5]來去除榛蘑多糖溶液中的雜蛋白質(zhì)。配制氯仿-正丁醇溶液，兩者的體積比為4 ∶ 1，在榛蘑多糖溶液中加入其1/4體積的氯仿-正丁醇溶液，將其置于大錐形瓶中，充分搖勻30 min之后，靜置，去除溶液下面的白色混濁物；取上清液于另一錐形瓶中，重復(fù)操作3～4次后，即可除去榛蘑多糖溶液中的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2 1 單因素試驗(yàn)條件確定

2 1 1 物料粒度對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖1可知，20、40、60、80目的榛蘑粉提取的多糖分別為10 26%、1048%、10 65%和12 08%，由此可知80目的榛蘑粉提取的多糖最高，因此試驗(yàn)選定物料粒度為80目。

2 1 2 料水質(zhì)量比對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖2可知，料水質(zhì)量比為1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20的條件下榛蘑粉提取的多糖分別為7 02%、10 24%、11 97%和12 37%，因此試驗(yàn)確定料水質(zhì)量比為1 ∶ 20。

2 1 3 pH值對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖3可知，pH值為4 5、5 5、6 5、7 5的條件下榛蘑粉提取的多糖為1081%、10 47%、12 93%和10 04%，由此可知pH值為6 5時(shí)的榛蘑粉提取的多糖最高（圖3），因此試驗(yàn)選定pH值為6 5。

2 1 4 溫度對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖4可知，溫度為30、40、50、60 ℃的條件下榛蘑提取的多糖分別為11 63%、12 88%、13 69%和12 59%，當(dāng)溫度在30～50 ℃之間時(shí)，隨著溫度的升高，多糖提取率較快地增長(zhǎng)，繼續(xù)升高溫度提取的多糖便有了下降的趨勢(shì)，因此試驗(yàn)確定溫度為50 ℃。

2 1 5 時(shí)間對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖5可知，時(shí)間為0 5、1 0、1 5、2 0 h的條件下測(cè)定榛蘑粉的多糖提取率，以2 0 h的條件下最高，因此試驗(yàn)選定時(shí)間為2 0 h。

2 1 6 加酶質(zhì)量比對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖6可以看出，當(dāng)加酶總量為底物的1%時(shí)，隨著加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶：纖維素酶）的增大提取的多糖也逐漸增加，當(dāng)酶比為3 ∶ 1時(shí)，提取率開始下降，考慮到酶的成本及效果，加酶質(zhì)量比應(yīng)為2 ∶ 1。

2 2 榛蘑多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2 2 1 因素與水平 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響榛蘑多糖提取的主要因素加酶（加酶總量為底物的1%）質(zhì)量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶）、酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)（表1），確定提取榛蘑多糖的最佳條件。

2 2 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2中4個(gè)因素的極差值可知，影響榛蘑多糖提取率的4個(gè)因素的主次順序是A>B>D>C。通過正交試驗(yàn)可知復(fù)合酶法提取榛蘑多糖的最佳工藝條件為A3B1C2D3，即加酶質(zhì)量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶）為 3 ∶ 1，酶解溫度為40 ℃，pH值6 5，酶解時(shí)間2 0 h，此時(shí)榛蘑多糖的提取率為16 85%。

2 3 榛蘑粗多糖的脫色與醇沉提取

將除凈蛋白質(zhì)的多糖溶液用20 g/L的活性炭脫色1 h，抽濾后再10 000 r/min離心10 min。將離心后的上清液放入錐形瓶中，加入大于溶液體積75%的乙醇，然后置于4 ℃冰箱中醇沉24 h。取出后用離心機(jī)8 000 r/min離心15 min，取出沉淀物放入表面皿中，在真空干燥箱中干燥，得到榛蘑粗多糖。

2 4 色譜分離純化

取粗多糖10 mL上柱。用恒流泵控制流速（20 mL/h），自[CM（25]動(dòng)部分收集器收集，每管收集2 0 mL，用苯酚-硫酸法測(cè)定各洗脫液于490 nm處的吸光度，收集其流出液，冷凍干燥得到純化樣品。

2 5 榛蘑多糖結(jié)構(gòu)紅外吸收光譜分析結(jié)果

紅外光譜和分子結(jié)構(gòu)有著極其密切的關(guān)系，已成為測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的一種重要方法。由于紅外光譜儀的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在已成為一種常規(guī)的分析測(cè)試手段。由圖7可知，由多糖中O—H、N—H伸縮振動(dòng)引起3 418 17 cm -1處的峰值；在2 929 88 cm -1處吸收峰是由多糖中C—H的伸縮振動(dòng)引起的，是糖類的特征吸收；在1 641 61 cm -1處吸收峰是—CHO的C[FY=，1]O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，為肽鏈上酰胺碳基的吸收峰；在1 402 05 cm -1處吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸縮振動(dòng)引起的；在1 247 92 cm -1處的吸收峰是由多糖中C[FY=，1]O的對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起的，說明有羧酸的存在；在1 137 32 cm -1處吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸縮振動(dòng)引起的；在1 073 57 cm -1處吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸縮振動(dòng)引起的；在871 88 cm -1為β-吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)吸收峰；在805 52 cm -1處是由吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)引起的。由此可知，榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

2 6 榛蘑多糖結(jié)構(gòu)紫外吸收光譜分析結(jié)果

紫外吸收光譜應(yīng)用廣泛，可用于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)表征和有機(jī)化合物的定量分析 [6]。由圖8可知，得到的紫外吸收光譜顯示核酸和蛋白質(zhì)的含量較小，因?yàn)樵诤怂幔ㄎ辗?60 nm）和蛋白質(zhì)（吸收峰280 nm）吸收波長(zhǎng)處未出現(xiàn)峰值。

3 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)中，首先采用單因素試驗(yàn)確定優(yōu)化條件，即：物料粒度為80目，料液質(zhì)量比為1 ∶ 20，然后采用正交試驗(yàn)的方法來進(jìn)一步優(yōu)化榛蘑多糖的提取條件，得到提取榛蘑多糖的最佳優(yōu)化條件，即為提取溫度40 ℃，pH值6 5，酶解時(shí)間2 0 h， 加酶（加酶總量為底物的1%）質(zhì)量比（木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶） 3 ∶ 1，最佳優(yōu)化條件的榛蘑多糖提取率達(dá)到16 85%。

采用Spectum one傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)干燥后的榛蘑多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，由多糖中O—H、N—H伸縮振動(dòng)引起 3 418 17 cm -1處的峰值；在2 929 88 cm -1處吸收峰是由多糖中C—H的伸縮振動(dòng)引起的，是糖類的特征吸收；在1 641 61 cm -1處吸收峰是—CHO的C[FY=，1]O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，為肽鏈上酰胺碳基的吸收峰；在1 402 05 cm -1處吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸縮振動(dòng)引起的；在1 247 92 cm -1處的吸收峰是由多糖中C[FY=，1]O的對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起的，說明有羧酸的存在；在1 137 32 cm -1處吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸縮振動(dòng)引起的；在1 073 57 cm -1 處吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸縮振動(dòng)引起的；在871 88 cm -1為β-吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)吸收峰；在805 52 cm -1處是由吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)引起的。由此可知，榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

采用Lambda-35型紫外可見光分光光度計(jì)對(duì)榛蘑多糖進(jìn)行紫外光譜掃描，得到一條較為光滑的曲線，在260 nm和280 nm處都沒有出現(xiàn)峰值，由此可知榛蘑多糖中核酸和蛋白質(zhì)的含量較少。

參考文獻(xiàn)：

[1] 秦俊哲，呂嘉櫪 食用菌栽培學(xué)[M] 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2002：213

[2]Franz G Polysaccharides in pharmacy：current applications and future concepts[J] Planta Medica，1989，55（6）：493-497

[3]邵信儒，孫海濤，趙曉春 山榛蘑多糖提取工藝研究[J] 食品工業(yè)科技，2010，31（2）：224-225，228

[4]王小東，慧 玲，王順啟 真菌多糖的研究進(jìn)展[J] 江西科學(xué)，2005，23（3）：43-46

[5]Sham P Y，Scaman C H，Durance T D Texture of vacuum microwave dehydrated apple chips as affected by calcium pretreatment，vacuum level and apple variety[J] Journal of Food Science，2001，66（9）：1341-1347

[6]葉姜瑜，談 鋒 紫芝多糖的純化及組分分析[J] 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，27（6）：945-949