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    多酶法提取榛蘑多糖及光譜研究

    2015-09-10 12:44:25鄒東恢郭宏文
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年8期
    關(guān)鍵詞:正交試驗(yàn)

    鄒東恢 郭宏文

    摘要: 研究了多酶法提取榛蘑多糖的最佳條件并進(jìn)行光譜研究,通過單因素和正交試驗(yàn)確定了酶法提取榛蘑多糖的最佳工藝,即:粒度80目,料水比1 ∶ 20,酶作用溫度40 ℃,加酶(加酶總量為底物的1%)質(zhì)量比(木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶)3 ∶ 1,pH值6 5,酶作用時(shí)間2 0 h;在此條件下多糖的提取率可達(dá)16 85%。紅外光譜分析表明榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

    關(guān)鍵詞: 榛蘑多糖;多酶法提?。徽辉囼?yàn);光譜分析

    中圖分類號(hào): R284 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)08-0276-03

    榛蘑多糖(AMP)是從榛蘑菌絲體、子實(shí)體和發(fā)酵產(chǎn)物中分離而來的,是一種能夠控制細(xì)胞的分裂分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的活性多糖,同時(shí)它還具有抗輻射、促進(jìn)造血、抑制腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用 [1-2]。此外,榛蘑多糖也具有一定的抗氧化能力,可以用于制備具有抗氧化活性的天然活性物質(zhì)。榛蘑多糖提取可以采用熱水、稀酸、稀堿作為浸提劑,也可采用微波法、超聲波法輔助提取,浸提法是提取榛蘑多糖的傳統(tǒng)方法,但時(shí)間長(zhǎng)、效率低、能耗大 [3],多糖的提取率普遍不高。酶法提取多糖簡(jiǎn)單快捷、省時(shí)低耗,對(duì)榛蘑多糖的工業(yè)化提取及生產(chǎn)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

    1 材料與方法

    1 1 原料處理

    將市場(chǎng)上購買的榛蘑根部去除后,用清水清洗干凈,用剪刀將菌傘剪成適當(dāng)?shù)男K,放入真空干燥箱中干燥,用粉碎機(jī)粉碎,將粉碎后的榛蘑干粉依次通過20、40、60、80目的篩子,之后將各級(jí)的榛蘑粉放入潔凈干燥的燒杯中,并將其置于干燥箱中待用。

    1 2 試劑與儀器

    SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵:河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;離心機(jī):上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;RH-Q型全溫振蕩器:江蘇省全壇市榮華儀器制造有限公司;722紫外分光光度計(jì):北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Lambda-35紫外可見分光光度計(jì):美國(guó)PE公司;木瓜蛋白酶:北京世紀(jì)時(shí)尚科貿(mào)有限公司;纖維素酶:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所使用的試劑均為分析純。

    1 3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    以測(cè)定的吸光度D作為縱坐標(biāo),葡萄糖的質(zhì)量濃度C作為橫坐標(biāo),用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12 313 0x-0 029 1,相關(guān)系數(shù)為r=0 999 1。

    1 4 酶法提取榛蘑多糖的方法

    精確稱取80目的榛蘑粉2 g于錐形瓶中,按照一定的料水質(zhì)量比加入蒸餾水,用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值,按照一定加酶比加入木瓜蛋白酶和纖維素酶(加酶總量為底物的1%),在恒溫振蕩器上振蕩一定時(shí)間,用100 ℃沸水鍋水浴10 min,滅酶,在冷卻至室溫之后,用 8 000 r/min 離心機(jī)離心10 min,取上清液,即得到酶提取多糖清液。

    1 5 多糖總量的測(cè)定

    采用苯酚-硫酸比色法 [4]。硫酸-苯酚法是以硫酸、苯酚作為顯色劑,與榛蘑多糖發(fā)生顯色反應(yīng),在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,再通過已經(jīng)測(cè)定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得榛蘑中的多糖含量。

    1 6 蛋白質(zhì)去除方法

    本試驗(yàn)采用Sevage法 [5]來去除榛蘑多糖溶液中的雜蛋白質(zhì)。配制氯仿-正丁醇溶液,兩者的體積比為4 ∶ 1,在榛蘑多糖溶液中加入其1/4體積的氯仿-正丁醇溶液,將其置于大錐形瓶中,充分搖勻30 min之后,靜置,去除溶液下面的白色混濁物;取上清液于另一錐形瓶中,重復(fù)操作3~4次后,即可除去榛蘑多糖溶液中的蛋白質(zhì)。

    2 結(jié)果與分析

    2 1 單因素試驗(yàn)條件確定

    2 1 1 物料粒度對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖1可知,20、40、60、80目的榛蘑粉提取的多糖分別為10 26%、1048%、10 65%和12 08%,由此可知80目的榛蘑粉提取的多糖最高,因此試驗(yàn)選定物料粒度為80目。

    2 1 2 料水質(zhì)量比對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖2可知,料水質(zhì)量比為1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20的條件下榛蘑粉提取的多糖分別為7 02%、10 24%、11 97%和12 37%,因此試驗(yàn)確定料水質(zhì)量比為1 ∶ 20。

    2 1 3 pH值對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖3可知,pH值為4 5、5 5、6 5、7 5的條件下榛蘑粉提取的多糖為1081%、10 47%、12 93%和10 04%,由此可知pH值為6 5時(shí)的榛蘑粉提取的多糖最高(圖3),因此試驗(yàn)選定pH值為6 5。

    2 1 4 溫度對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖4可知,溫度為30、40、50、60 ℃的條件下榛蘑提取的多糖分別為11 63%、12 88%、13 69%和12 59%,當(dāng)溫度在30~50 ℃之間時(shí),隨著溫度的升高,多糖提取率較快地增長(zhǎng),繼續(xù)升高溫度提取的多糖便有了下降的趨勢(shì),因此試驗(yàn)確定溫度為50 ℃。

    2 1 5 時(shí)間對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖5可知,時(shí)間為0 5、1 0、1 5、2 0 h的條件下測(cè)定榛蘑粉的多糖提取率,以2 0 h的條件下最高,因此試驗(yàn)選定時(shí)間為2 0 h。

    2 1 6 加酶質(zhì)量比對(duì)榛蘑多糖提取的影響 從圖6可以看出,當(dāng)加酶總量為底物的1%時(shí),隨著加酶質(zhì)量比(木瓜蛋白酶:纖維素酶)的增大提取的多糖也逐漸增加,當(dāng)酶比為3 ∶ 1時(shí),提取率開始下降,考慮到酶的成本及效果,加酶質(zhì)量比應(yīng)為2 ∶ 1。

    2 2 榛蘑多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

    2 2 1 因素與水平 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇影響榛蘑多糖提取的主要因素加酶(加酶總量為底物的1%)質(zhì)量比(木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶)、酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)(表1),確定提取榛蘑多糖的最佳條件。

    2 2 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由表2中4個(gè)因素的極差值可知,影響榛蘑多糖提取率的4個(gè)因素的主次順序是A>B>D>C。通過正交試驗(yàn)可知復(fù)合酶法提取榛蘑多糖的最佳工藝條件為A3B1C2D3,即加酶質(zhì)量比(木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶)為 3 ∶ 1,酶解溫度為40 ℃,pH值6 5,酶解時(shí)間2 0 h,此時(shí)榛蘑多糖的提取率為16 85%。

    2 3 榛蘑粗多糖的脫色與醇沉提取

    將除凈蛋白質(zhì)的多糖溶液用20 g/L的活性炭脫色1 h,抽濾后再10 000 r/min離心10 min。將離心后的上清液放入錐形瓶中,加入大于溶液體積75%的乙醇,然后置于4 ℃冰箱中醇沉24 h。取出后用離心機(jī)8 000 r/min離心15 min,取出沉淀物放入表面皿中,在真空干燥箱中干燥,得到榛蘑粗多糖。

    2 4 色譜分離純化

    取粗多糖10 mL上柱。用恒流泵控制流速(20 mL/h),自[CM(25]動(dòng)部分收集器收集,每管收集2 0 mL,用苯酚-硫酸法測(cè)定各洗脫液于490 nm處的吸光度,收集其流出液,冷凍干燥得到純化樣品。

    2 5 榛蘑多糖結(jié)構(gòu)紅外吸收光譜分析結(jié)果

    紅外光譜和分子結(jié)構(gòu)有著極其密切的關(guān)系,已成為測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的一種重要方法。由于紅外光譜儀的廣泛應(yīng)用,現(xiàn)在已成為一種常規(guī)的分析測(cè)試手段。由圖7可知,由多糖中O—H、N—H伸縮振動(dòng)引起3 418 17 cm -1處的峰值;在2 929 88 cm -1處吸收峰是由多糖中C—H的伸縮振動(dòng)引起的,是糖類的特征吸收;在1 641 61 cm -1處吸收峰是—CHO的C[FY=,1]O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的,為肽鏈上酰胺碳基的吸收峰;在1 402 05 cm -1處吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸縮振動(dòng)引起的;在1 247 92 cm -1處的吸收峰是由多糖中C[FY=,1]O的對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起的,說明有羧酸的存在;在1 137 32 cm -1處吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸縮振動(dòng)引起的;在1 073 57 cm -1處吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸縮振動(dòng)引起的;在871 88 cm -1為β-吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)吸收峰;在805 52 cm -1處是由吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)引起的。由此可知,榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

    2 6 榛蘑多糖結(jié)構(gòu)紫外吸收光譜分析結(jié)果

    紫外吸收光譜應(yīng)用廣泛,可用于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)表征和有機(jī)化合物的定量分析 [6]。由圖8可知,得到的紫外吸收光譜顯示核酸和蛋白質(zhì)的含量較小,因?yàn)樵诤怂幔ㄎ辗?60 nm)和蛋白質(zhì)(吸收峰280 nm)吸收波長(zhǎng)處未出現(xiàn)峰值。

    3 結(jié)果與討論

    本試驗(yàn)中,首先采用單因素試驗(yàn)確定優(yōu)化條件,即:物料粒度為80目,料液質(zhì)量比為1 ∶ 20,然后采用正交試驗(yàn)的方法來進(jìn)一步優(yōu)化榛蘑多糖的提取條件,得到提取榛蘑多糖的最佳優(yōu)化條件,即為提取溫度40 ℃,pH值6 5,酶解時(shí)間2 0 h, 加酶(加酶總量為底物的1%)質(zhì)量比(木瓜蛋白酶 ∶ 纖維素酶) 3 ∶ 1,最佳優(yōu)化條件的榛蘑多糖提取率達(dá)到16 85%。

    采用Spectum one傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)干燥后的榛蘑多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,由多糖中O—H、N—H伸縮振動(dòng)引起 3 418 17 cm -1處的峰值;在2 929 88 cm -1處吸收峰是由多糖中C—H的伸縮振動(dòng)引起的,是糖類的特征吸收;在1 641 61 cm -1處吸收峰是—CHO的C[FY=,1]O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的,為肽鏈上酰胺碳基的吸收峰;在1 402 05 cm -1處吸收峰是由多糖中C—O—C和C—O—H的伸縮振動(dòng)引起的;在1 247 92 cm -1處的吸收峰是由多糖中C[FY=,1]O的對(duì)稱性伸縮振動(dòng)引起的,說明有羧酸的存在;在1 137 32 cm -1處吸收峰是由多糖中D-吡喃葡萄糖伸縮振動(dòng)引起的;在1 073 57 cm -1 處吸收峰是由多糖中β-D-吡喃葡萄糖苷伸縮振動(dòng)引起的;在871 88 cm -1為β-吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)吸收峰;在805 52 cm -1處是由吡喃環(huán)中C1—H的變角振動(dòng)引起的。由此可知,榛蘑多糖為含有葡萄糖醛酸的β-吡喃多糖。

    采用Lambda-35型紫外可見光分光光度計(jì)對(duì)榛蘑多糖進(jìn)行紫外光譜掃描,得到一條較為光滑的曲線,在260 nm和280 nm處都沒有出現(xiàn)峰值,由此可知榛蘑多糖中核酸和蛋白質(zhì)的含量較少。

    參考文獻(xiàn):

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