花椒提取物對薏苡黑粉病菌的抑菌機理

莫熙禮　吳彤林　李松克等

摘要： 從角質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶以及細胞膜透性等方面研究花椒提取物對薏苡黑粉病菌的抑制機理。結(jié)果表明：花椒提取物處理后，黑粉病菌的果膠酶和纖維素酶的活性顯著弱于對照，說明花椒提取物能夠抑制病原物的致病相關(guān)酶活性的表達，進而減輕黑粉病菌的危害；花椒提取物處理后，孢子培養(yǎng)液的電導率及其變化率都隨著時間的延長而變大，處理9 h后菌絲電導率變化率為9.52%，說明花椒提取物對菌絲的細胞膜有很強的破壞作用，導致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而迅速增加菌絲培養(yǎng)液的電導率。黑粉病菌的果膠酶以及纖維素酶的活性都在6 h時達到峰值，之后活性開始降低，說明該病菌在6 h時能夠沖破植物各種抵抗屏障，成功侵入寄主植物。黑粉病菌分泌的角質(zhì)酶的量很低，這可能是薏苡黑粉病菌極少能從薏苡葉片侵入的關(guān)鍵因子之一。

關(guān)鍵詞： 花椒；抑制機理；黑粉病菌；薏苡

中圖分類號：S435.19 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2015）08-0131-02

薏苡（Coix lacrymajobi L.var. frumentac）別稱六谷子、珍珠米等，是貴州省黔西南極具特色的主要經(jīng)濟作物，為貴州省黔西南州農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)民增收作出了重要貢獻。近年來，隨著薏苡種植規(guī)模的擴大，薏苡黑粉病大面積頻繁發(fā)生，直接影響了薏苡的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，已成為薏苡生產(chǎn)的重要制約因素，對貴州省黔西南州薏苡種植區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟收入構(gòu)成了嚴重威脅。植物源殺菌劑對薏苡黑粉病抑制作用方面的研究國內(nèi)外未見報道。由于對該病害的病原物還不甚了解，因此對該病害的防治也比較盲目。植物源殺菌劑是指用具有殺菌、抑菌活性的植物部位或有效成分提取物以及分離純化的單體物質(zhì)加工而成的用于防治植物病害的藥劑 [1]。因此，加強新型天然植物源殺菌劑的研制具有非常重要的現(xiàn)實意義。

植物病原菌侵入植物需要克服2道屏障——角質(zhì)層和細胞壁。病原物通過合成和分泌角質(zhì)酶降解植物體表的角質(zhì)，以沖破第1道屏障，降低植物自身的防御能力 [2]。很多植物病原菌都能分泌各種細胞壁降解酶，這些酶能夠降解細胞壁，是真菌的重要致病因子之一 [3]。因此，本試驗在已有研究基礎(chǔ)上，從花椒提取物對薏苡黑粉病菌角質(zhì)酶和細胞降解酶的抑制作用方面研究植物提取物抑菌機制，為進一步闡明植物提取物對病原菌抑制機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌

薏苡黑粉病菌采集于黔西南州農(nóng)作物科學研究所薏苡示范基地。在薏苡果實上分離得到病瘤，風干后存放于紙盒內(nèi)，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们皩⒉×瞿胨椴⑦^40目篩，得到菌粉。

1.2 花椒提取物的制備

花椒采集于貴州省興義市頂效。將陰干的植物材料放至恒溫烘箱內(nèi)50 ℃烘干，粉碎后過40目篩，置于密封袋中，低溫保存?zhèn)溆?。花椒的提取采取CEP提取法 [4]，將花椒提取物配制成濃度為0.125 mg/mL的溶液。

1.3 角質(zhì)酶活性的測定

稱取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL角質(zhì)酶培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測定角質(zhì)酶活性的變化。角質(zhì)酶培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取及酶活性的測定（波長405 nm）參考吳潔云的方法 [5]。以1 mg酶蛋白 1 min 內(nèi)吸光度為1個酶單位（U）。

1.4 β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（EG）活性的測定

稱取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL EG培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測定EG活性的變化。培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取以及EG活性（540 nm）的測定參考董小梅的方法 [6]。以1 h 1 mg蛋白催化底物產(chǎn)生 1 μmol 還原糖所需的酶量為1個酶單位（U）。

1.5 果膠酶活性的測定

稱取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL果膠酶培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測定多聚半乳糖酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的變化。果膠酶培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取、PG以及PMG活性的測定（540 nm）參考楊迎青等的方法 [7]。以1 h 1 mg蛋白催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1酶單位（U）。

1.6 細胞膜透性的檢測

細胞膜透性的測定參考楊海清的方法 [8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒提取物對黑粉病菌角質(zhì)酶活性的影響

由圖1可知，花椒提取物處理后，薏苡黑粉病菌孢子產(chǎn)生角質(zhì)酶活性與對照處理差異不明顯，且角質(zhì)酶活性都很弱。對照和花椒處理的角質(zhì)酶都在6 h時到達峰值。

2.2 花椒提取物對黑粉病菌EG活性的影響

由圖2可見，對照黑粉病菌EG活性增強較快，于6 h時達到峰值，且花椒提取物處理的黑粉病菌EG活性明顯弱于對照。說明花椒提取物能夠減弱制病菌的EG活性。

2.3 花椒提取物對黑粉病菌果膠酶活性的影響

圖3、圖4表明，對照病菌PG、PMG活性從開始就逐漸增強，于6 h時都到達峰值，而花椒提取物處理病菌PG、PMG活性在試驗過程中增強不明顯。說明花椒提取物對黑粉病菌果膠酶有抑制作用。

2.4 花椒提取物對薏苡黑粉菌細胞膜透性的影響

試驗結(jié)果（表1）表明，經(jīng)花椒提取物處理后，孢子培養(yǎng)液的電導率及其變化率都隨著時間的延長而變大。經(jīng)花椒提取物處理6 d后，菌絲的電導率顯著高于CK。處理9 h后，菌絲的電導率變化率達到9.52%。說明花椒提取物對菌絲的細胞膜有很強的破壞作用，導致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而迅速提高了菌絲培養(yǎng)液的電導率。

3 結(jié)論與討論

角質(zhì)層是阻止病原真菌侵入寄主植物的第1道屏障，很多植物病原菌通過合成和分泌角質(zhì)酶迅速降解寄主植物的角質(zhì)，降低其防御能力，以達到侵害的目的 [2]。國外學者在病原物侵入位點發(fā)現(xiàn)了角質(zhì)酶的存在，且病原物的致病性與角質(zhì)酶的表達量呈正相關(guān) [9]。因此，降低某種病原物角質(zhì)酶的表達量，可以一定程度上減輕該病原物的危害。Li等研究發(fā)現(xiàn)，缺少角質(zhì)酶基因的菌株不能直接沖破油菜葉片的角質(zhì)層 [10]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑粉病菌分泌的角質(zhì)酶的量很小，可能不足以破壞寄主的角質(zhì)層。這可能是薏苡黑粉病菌極少能從薏苡葉片侵入的重要因子之一。

細胞壁是阻止病原真菌侵入的第2道屏障，大部分植物病原真菌通過分泌細胞壁降解酶降解細胞壁，從而達到危害寄主植物的目的 [3]。因此，提高植物抵抗細胞壁降解酶的能力或者抑制細胞壁降解酶的表達量，可以達到減輕病原物危害的目的。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)花椒提取物處理薏苡黑粉病菌后，該病菌的細胞壁降解酶（β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶、多聚半乳糖酸酶以及果膠甲基半乳糖醛酸酶）表達量明顯低于對照，說明花椒提取物對病原菌的細胞壁降解酶具有很強的抑制作用。

本試驗用電導率儀測定了花椒提取物對薏苡黑粉病菌菌絲細胞膜的影響，結(jié)果表明花椒提取物對黑粉病菌菌絲細胞膜具有很強的破壞作用，破壞作用隨著時間的延長而增強，這與楊海清的研究結(jié)果 [8]相符。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，薏苡黑粉病菌細胞壁降解酶活性均在 6 h 時達到峰值，之后開始減弱。說明該病菌只需6 h就能夠完全激發(fā)各種致病相關(guān)酶的活性，最大程度破壞寄主植物的各種抵抗屏障，成功侵入寄主植物。

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