金線蓮叢生芽增殖的液體懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉榮+申剛+羅曉青等

摘要： 研究金線蓮液體懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基和不同激素濃度配比對叢生芽增殖的影響，以篩選出金線蓮叢生芽增殖液體懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基和激素濃度配比，提高叢生芽增殖系數(shù)，為金線蓮快速繁殖開辟一條新途徑。結(jié)果表明：影響液體懸浮培養(yǎng)金線蓮叢生芽增殖的主要因素是基本培養(yǎng)基和6-芐氨基嘌呤（6-BA），主次關(guān)系為6-BA>NAA>IAA>2，4-D。篩選得到的最佳培養(yǎng)條件是1/2MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IAA 0.3 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L，外加蔗糖30 g/L，pH 值5.8。

關(guān)鍵詞： 金線蓮；叢生芽增殖；懸浮培養(yǎng)；正交設(shè)計

中圖分類號： S682.310.4+3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0061-02

金線蓮[Anoectochilus roxburghii（Wall. ）Lindl]是一種蘭科開唇蘭屬多年生草本，具有清熱涼血、除濕解毒等多種功效，兼具賞葉和觀花之功用，民間稱其為“神藥” [1-2]。金線蓮喜陰涼、潮濕，為典型的陰性藥用植物 [3]。因野生資源瀕危，而且其種子小、種胚發(fā)育不全、發(fā)芽困難、對生長條件要求頗為嚴格，所以在自然條件下，該植物難以大量繁殖，利用組織培養(yǎng)進行繁殖可以有效保存種質(zhì)資源及用于商業(yè)化生產(chǎn) [3-5]。通過組織培養(yǎng)方法對珍稀植物進行快繁研究，不僅可以克服種子繁殖中存在的諸多問題，還可以克服扦插繁殖速度慢、繁殖率低、難生根等缺點，而且組織培養(yǎng)繁殖快，不受季節(jié)、環(huán)境條件和場地的制約 [6]。近年來，研究者們先后開展了金線蓮的組織培養(yǎng)、內(nèi)生真菌的分離、內(nèi)生真菌與其共培養(yǎng)體系的建立及相互作用機制的研究 [7-11]。目前，金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)主要通過原球莖增殖和叢生芽增殖2種途徑進行。多數(shù)研究集中在原球莖增殖途徑，但其歷時較長且后代再生植株中有較高的變異率 [12-13]，而叢生芽增殖途徑能夠克服此類難題 [14]。由于固體培養(yǎng)基存在營養(yǎng)分配不均、接觸面積小等缺點，金線蓮叢生芽增殖途徑速度依然較慢，生長不均勻，影響標準化生產(chǎn)體系的建立。因此，食用液體懸浮培養(yǎng)可彌補以上缺點。本試驗研究了液體懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基和不同激素濃度配比對叢生芽增殖的影響，旨在為金線蓮的快速繁殖開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野外采集的金線蓮植株。將采集回來的野生金線蓮用自來水沖洗干凈，徹底清理葉、葉苞鞘、根，用肥皂水浸泡 20 min，流水沖洗30 min，在超凈工作臺用75%乙醇消毒 30 s，0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水洗3～5次，無菌濾紙拭干，將植株切為0.5 cm帶節(jié)莖段，接種于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽。

1.2 基本培養(yǎng)基的選擇

以MS、1/2MS、1/4MS為液體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基同時添加6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖 30 g/L，pH值調(diào)至5.8。接種莖段于裝有50 mL基本培養(yǎng)基的三角瓶中，在25 ℃ 120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)45 d，比較增殖效果。

1.3 激素濃度配比的篩選

以1/2MS+30 g/L蔗糖為基本培養(yǎng)基，采用L9（34） 4因素3水平正交試驗篩選6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚乙酸（IAA） 的最佳配比，試驗因素水平見表1。選取在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的顏色較綠、長勢良好的叢生芽作為接種材料，每個處理20瓶，每瓶接種5個叢生芽，接種后在25 ℃ 120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)45 d后觀察長勢，計數(shù)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 200軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對叢生芽增殖的影響

由表2可見，金線蓮在1/2MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的芽數(shù)達到最高，生長狀況最佳，其后依次為1/4MS、MS。由此看出，1/2MS是金線蓮叢生芽增殖的最佳液體基本培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度激素配比對叢生芽增殖的影響

正交試驗方差分析。從單因素水平出發(fā)，由表4、表5可見，6-BA對增殖芽數(shù)有顯著影響（P<0.05），其他激素?zé)o顯著影響，所以數(shù)據(jù)未列出。方差分析結(jié)果（表6）表明，6-BA 的P<0.05，NAA 和IAA的P>0.05；而且F值顯示6-BA>NAA>IAA，說明6-BA能顯著促進金線蓮液體懸浮培養(yǎng)叢生芽增殖，而NAA 和IAA表現(xiàn)為無顯著性差異。綜合以上試驗結(jié)果，金線蓮液體懸浮培養(yǎng)叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)條件是6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IAA 0.3 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L，外加蔗糖30 g/L，pH值5.8。

3 結(jié)論與討論

金線蓮的組織培養(yǎng)技術(shù)研究較早，影響其組織培養(yǎng)的因素主要有基本培養(yǎng)基、不同添加物、激素配比及培養(yǎng)條件等，其中激素配比尤為重要 [15-17]。金線蓮成苗主要通過原球莖和叢生芽2種途徑進行，據(jù)相關(guān)研究，原球莖的年理論增殖系數(shù)能達到1.83×106 [18]。但是原球莖途徑從誘導(dǎo)起始材料開始，必須經(jīng)歷脫分化和再分化，這比叢生芽途徑多用2個多月的時間，而且長出來的苗大多數(shù)纖細，還必須壯苗才能培養(yǎng)出更好的植株，另外原球莖后代再生植株中變異率較高，難以保持母株的優(yōu)良遺傳特性。為了進一步減少遺傳變異的發(fā)生，有人提出采用叢生芽途徑直接出苗。這在大花蕙蘭和蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)快速繁殖中已取得成功 [19-20]。叢生芽途徑可以直接出苗，1個芽在2.5個月內(nèi)增殖6.53倍，年理論增殖系數(shù)約為0.82×104，其繁殖系數(shù)比原球莖低2個數(shù)量級，但叢生芽途徑繁殖周期短，而且可以跨越原球莖途徑中的分化、壯苗等；不僅節(jié)約了時間，還降低了生產(chǎn)成本，最主要的是叢生芽途徑再生植株變異率低，能較好地保持母株優(yōu)良特性。

液體懸浮培養(yǎng)在鐵皮石斛、大花蕙蘭等植物中已獲得成功。因此，本試驗確認1/2MS為金線蓮叢生芽液體懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗研究6-BA、NAA、2，4-D、 IAA等4種激素濃度配比對液體懸浮培養(yǎng)金線蓮叢生芽增值的影響，得出金線蓮液體懸浮培養(yǎng)叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)條件為6-BA 2 5 mg/L+NAA 0 2 mg/L+IAA 0 3 mg/L+2，4-D 0 5 mg/L，外加蔗糖30 g/L，pH值5 8。其中影響較大的激素是6-BA，其他3種激素對其的影響均不顯著。

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