雷公藤紅素通過ROS-JNK信號通路誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡

丁成國（杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州310006）

·實驗研究·

雷公藤紅素通過ROS-JNK信號通路誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡

丁成國
（杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州310006）

目的探討雷公藤紅素對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的生物效應(yīng)及其機(jī)制。方法將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G用各種不同濃度的雷公藤紅素處理后，采用MTT法檢測雷公藤紅素對T98G細(xì)胞活力的抑制作用；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測T98G細(xì)胞用雷公藤紅素處理后細(xì)胞的凋亡情況及ROS的產(chǎn)生；Western blot檢測T98G細(xì)胞用雷公藤紅素處理后cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表達(dá)水平。結(jié)果雷公藤紅素對T98G細(xì)胞活力的抑制效應(yīng)呈劑量依賴性，1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L雷公藤紅素組細(xì)胞活力抑制率分別為（15.3±1.1）%，（28.2±1.8）%，（37.4±2.6）%，（55.6±3.8）%，（71.3±5.1）%。雷公藤紅素可顯著誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡，對照組的凋亡率為 （2.1±0.3）%，1μmol/L雷公藤紅素組凋亡率為 （10.4±0.9）%，3μmol/L雷公藤紅素組凋亡率為 （22.5± 1.7）%。雷公藤紅素可顯著誘導(dǎo)T98G細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并使cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表達(dá)水平顯著上升。結(jié)論雷公藤紅素在體外有良好的抗神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物活性，誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與激活ROS-JNK信號通路有關(guān)。

雷公藤紅素；T98G；凋亡；ROS；JNK

近年的研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素除了有抗炎抗氧化作用外，對離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用［1-2］。為此，作者進(jìn)行雷公藤紅素體外激活ROS-JNK/caspase信號通路，抑制神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的活力并使其發(fā)生凋亡的實驗，探討雷公藤紅素抑制人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)本實驗研究的起止時間為2013 年12月～2015年3月。人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G購于美國 ATCC（American Type Culture Collection，#CRL-1690），腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。腫瘤細(xì)胞2天傳代1次，待培養(yǎng)至對數(shù)生長期，供實驗用。

1.2實驗試劑RPIM-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司（#11875-085）。胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司 （HB0205）。雷公藤紅素（celastrol，#C0869）購自美國Sigma Aldrich公司。二氫乙啶，N-乙酰半胱氨酸 （NAC，#A7250），SP600125（SP，#S5567），四甲基偶氮 （噻唑藍(lán)，MTT，#M2128），AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（#APOAC）均購于美國 Sigma Aldrich公司。β-actin （#4967）、cleaved caspase-3（激活型 caspase-3，#9661）、cleaved caspase-9（激活型 caspase-9，#7237）、p-JNK（激活型磷酸化JNK，#9255）抗體購自美國Cell signal公司。

1.3MTT試驗細(xì)胞活力檢測分組參照文獻(xiàn)進(jìn)行［2］，將T98G細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板，分別加入 1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物作為空白對照，所有組別設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)48小時后加入5mg/ mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清后，加二甲亞楓溶解細(xì)胞并顯色，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率計算公式：抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/OD對照組×100%。

1.4細(xì)胞凋亡試驗在T98G細(xì)胞中分別加入1μmol/L、3μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物，所有組別設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)48小時后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡率用Annexin-V陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示。

1.5ROS（活性氧簇）檢測在T98G細(xì)胞中分別加入3μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物，所有組別設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)48小時后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，將5μM二氫乙啶加入細(xì)胞中孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，ROS陽性細(xì)胞發(fā)射紅色熒光，因此腫瘤細(xì)胞ROS陽性率用發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示［3］。

1.6Western blot試驗在 T98G細(xì)胞中加入1μmol/L或3μmol/L雷公藤紅素，對照組不加藥物。培養(yǎng)48小時后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，之后將細(xì)胞裂解，將蛋白裂解液用 12.5%SDS PAGE進(jìn)行分離，之后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。將膜放入β-actin，cleaved caspase-3，cleaved caspase-9，p-JNK一抗稀釋液中孵育過夜，之后再用二抗稀釋液孵育2小時后在X線膠片上進(jìn)行曝光，之后用Image J圖像處理軟件進(jìn)行處理，使蛋白表達(dá)灰度值用數(shù)字表示，目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/相應(yīng)β-actin內(nèi)參蛋白灰度值。

2　結(jié)果

2.1雷公藤紅素對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的抑制作用雷公藤紅素有顯著的體外抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用，T98G細(xì)胞在不同濃度雷公藤紅素的作用下，其細(xì)胞活力均受到顯著抑制，見表1。

2.2雷公藤紅素誘導(dǎo)T98G發(fā)生caspase依賴的凋亡高低濃度的雷公藤紅素 （1μmol/L和3μmol/L）均能誘導(dǎo)T98G發(fā)生凋亡（圖1），同時激活caspase-9 和caspase-3（圖2），當(dāng)用caspase特異性抑制劑zVAD-fmk［3］抑制T98G細(xì)胞caspase的活性后，雷公藤紅素對T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)受到抑制，表明雷公藤紅素能誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生caspase介導(dǎo)的凋亡，見表2。

表1　不同濃度雷公藤紅素對T98G膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1　不同濃度雷公藤紅素對T98G膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制作用（±s）

與對照組比較*P＜0.05

組別　n/孔　細(xì)胞活力抑制率（%）對照組　3　0 1μmol/L雷公藤紅素組　3　15.3±1.1*2μmol/L雷公藤紅素組　3　28.2±1.8*3μmol/L雷公藤紅素組　3　37.4±2.6*4μmol/L雷公藤紅素組　3　55.6±3.8*5μmol/L雷公藤紅素組　3　71.3±5.1*

表2　不同濃度雷公藤紅素對T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

表2　不同濃度雷公藤紅素對T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（±s）

與對照組比較*P＜0.05，與1μmol/L雷公藤紅素組比較ΔP＜0.05，與3μmol/L雷公藤紅素組比較#P＜0.05

組別　n/孔　zVAD-fmk濃度（μmol/L）灰度比（cleaved caspase-9/β-actin）灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）凋亡率（%）對照組　3　0　0.03±0.01　0.02±0.01　2.1±0.3 1μmol/L雷公藤紅素組　3　0　0.27±0.04*　0.24±0.03*　10.4±0.9*3μmol/L雷公藤紅素組　3　0　0.59±0.04*　0.64±0.04*　22.5±1.7*1μmol/L雷公藤紅素+zVAD-fmk組　3　10　0.12±0.02Δ　0.11±0.02*Δ　5.5±0.7Δ3μmol/L雷公藤紅素+zVAD-fmk組　3　10　0.19±0.03*#　0.23±0.03*#　9.2±1.3*#

圖1　雷公藤紅素誘導(dǎo)的T98G細(xì)胞凋亡

圖2　雷公藤紅素激活caspase-9和caspase-3

2.3雷公藤紅素通過ROS-JNK/caspase信號通路誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素（3μmol/L）可顯著誘導(dǎo)T98G細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和JNK （c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）的活化。當(dāng)在T98G細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入ROS清除劑NAC（N-乙酰半胱氨酸）［4］后，雷公藤紅素?zé)o法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和ROS的產(chǎn)生，并且JNK的活化也同時受到抑制。當(dāng)在T98G培養(yǎng)體系中加入JNK特異性抑制劑SP600125（SP，也稱Anthrapyrazolone）［5］，抑制JNK活性后，雷公藤紅素?zé)o法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和JNK的活化，但對ROS的產(chǎn)生無影響。

表3　雷公藤紅素對T98G細(xì)胞ROS-JNK信號通路影響（±s）

表3　雷公藤紅素對T98G細(xì)胞ROS-JNK信號通路影響（±s）

與對照組比較*P＜0.05，與雷公藤紅素組比較△P＜0.05

組別　n/孔　雷公藤紅素濃度（μmol/L）NAC濃度（mmol/L）SP濃度（μmol/L）ROS陽性率（%）灰度比（p-JNK/β-actin）凋亡率（%）對照組　3　0　0　0　1.6±0.3　0.05±0.01　2.6±0.3雷公藤紅素組　3　3　0　0　36.4±3.7*　0.65±0.05*　25.2±2.1*雷公藤紅素+NAC組　3　3　10　0　10.4±1.1*△　0.23±0.03*△　11.4±0.8*△雷公藤紅素+SP組　3　3　0　50　35.0±3.9*　0.17±0.02*△　13.1±0.7*△

3　討論

雷公藤紅素是衛(wèi)矛科植物雷公藤T（ripterygium wilfordii Hook.f）的根或根的木質(zhì)部提取的三萜類化合物，目前臨床上主要用于自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病［6-7］。最近的研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素有顯著抗腫瘤效應(yīng)，對多種腫瘤類型都有很好的治療效果，如肝癌、乳腺癌和肺癌等［8-10］。然而雷公藤紅素抗腫瘤的分子機(jī)制至今仍不十分清楚，而且其對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是否有治療作用目前還未有過報道。作者通過體外實驗，證實了雷公藤紅素能有效抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的細(xì)胞活力，并且通過激活caspase-9和caspase-3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

活性氧簇ROS是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，少量的ROS有助于促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，然而過量的ROS能對細(xì)胞內(nèi)的脂類、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷［11-12］。有文獻(xiàn)表明，相比于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞往往處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，其對ROS濃度的升高更敏感［13］。此外，ROS還可激活下游信號通路（如MAPK通路）誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。JNK是MAPK蛋白家族的重要成員，與細(xì)胞的程序性死亡有關(guān)。Krajarng等［14］報道，JNK的激活能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了探究雷公藤紅素誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，作者用二氫乙啶染色法檢測T98G細(xì)胞的ROS水平，并用Western blot實驗檢測T98G細(xì)胞JNK的活化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞ROS的產(chǎn)生和JNK的活化。當(dāng)用NAC清除ROS后，雷公藤紅素的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)喪失，而且其對JNK的活化作用也喪失；而當(dāng)用SP阻斷JNK的磷酸化后，雷公藤紅素對T98G的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)也喪失，但對ROS的產(chǎn)生不受影響。上述的這些結(jié)果表明雷公藤紅素對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用依賴ROS的產(chǎn)生和JNK的活化。

綜上所述，本文結(jié)果表明雷公藤紅素有良好的體外抗神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物活性，其分子機(jī)制可能為激活ROS-JNK信號通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的凋亡。這些實驗結(jié)果為雷公藤紅素治療腫瘤的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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