IGF-1及IGF-1R在SD大鼠前列腺組織中的表達(dá)

熊 宇，黃 濤，吳 奎，劉 治，周杭城

IGF-1及IGF-1R在SD大鼠前列腺組織中的表達(dá)

熊 宇1，黃 濤1，吳 奎1，劉 治1，周杭城2

目的 研究不同飲食和丙酸睪酮對SD大鼠前列腺組織的改變及胰島素生長因子（IGF）-1、IGF-1R的表達(dá)強(qiáng)度。方法 采用高脂高糖飼料飲食及去勢后皮下注射丙酸睪酮建造前列腺增生模型，40 d后處死大鼠;取出前列腺組織，稱重并HE染色觀察前列腺增生情況;用免疫組化法檢測前列腺組織中IGF-1、IGF-1R的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果 高脂高糖飲食組前列腺組織增生，IGF-1、IGF-1R的表達(dá)強(qiáng)度均高于普通飲食組（P＜0.05）;去勢+低劑量丙酸睪酮皮下注射組前列腺組織明顯增生，IGF-1、IGF-1R的表達(dá)強(qiáng)度明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 高脂高糖飲食及低劑量丙酸睪酮均可促進(jìn)大鼠前列腺組織的增生，IGF-1、IGF-1R與前列腺增生的發(fā)展呈正相關(guān)性。

高脂高糖;丙酸睪酮;前列腺指數(shù);前列腺增生;胰島素生長因子1;胰島素生長因子1受體

前列腺增生是一種緩慢的漸進(jìn)的老年男性常見疾病［1］，約2/3患者有尿頻、尿急、夜尿增多癥狀，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)行性排尿困難，嚴(yán)重影響老年男性的生活質(zhì)量和睡眠模式［2］。近年來中國人口老齡化加劇，飲食結(jié)構(gòu)改變明顯，前列腺增生發(fā)病率顯著升高。該研究通過高糖高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠并對去勢大鼠皮下注射不同劑量的丙酸睪酮建立大鼠前列腺增生模型，并對前列腺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，探討高脂高糖飲食及外源性睪酮對SD大鼠前列腺的影響及IGF-1、IGF-1R與大鼠前列腺增生發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)條件

1.1.1 SD大鼠選擇及分組 健康清潔級 SD雄性大鼠40只，120～200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，以上SD大鼠先給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，第4天所有大鼠隨機(jī)分為普通飲食組（A組）和高脂高糖飲食組（B組），兩組大鼠再隨機(jī)各分4組，每組各5只。A1組:普食飲食未處理;A2組:普通飲食+手術(shù)去勢+生理鹽水5 mg/（kg·d）皮下注射;A3組:普通飲食 +手術(shù)去勢 +睪酮 2 mg/（kg·d）皮下注射;A4組:普通飲食+手術(shù)去勢+睪酮5 mg/（kg·d）皮下注射;B1組:高糖高脂飲食未處理;B2組:高糖高脂飲食+手術(shù)去勢+生理鹽水5 mg/（kg·d）皮下注射;B3組:高糖高脂飲食+手術(shù)去勢+睪酮2 mg/（kg·d）皮下注射;B4組:高糖高脂飲食+手術(shù)去勢+睪酮5 mg/（kg·d）皮下注射。

1.1.2 飼養(yǎng)條件和飼料配方 室溫 （22±2）℃，濕度 （50±10）%，光照條件6時(shí)～18時(shí)，水和飼料充足，實(shí)驗(yàn)前普通飼料料養(yǎng)適應(yīng)3 d。普通飼料由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;高糖高脂飼料在普通飼料的基礎(chǔ)上加動(dòng)物油脂 （豬油10%）、蔗糖（7%）、伊利全脂奶粉 （10%）、蛋黃 （6%）、豆粉（2%），由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心混合配制成棒狀飼料喂養(yǎng)。

1.1.3 藥品及試劑 丙酸睪丸酮注射液 （25 mg/ml）購自天津金耀氨基酸有限公司（批號:1202081）;10%水合氯醛由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;IGF-1抗體 （產(chǎn)品編號bs-4588R）、IGF-1R抗體（產(chǎn)品編號bs-4985R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;通用型 kit兔/小鼠（產(chǎn)品編號PV-6000）、DAB染色劑 （產(chǎn)品編號ZLI-9018）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 免疫組織化學(xué) 采用SP法，參照免疫組化染色試劑盒說明書。選擇厚度為4 μm組織，蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，其中陰性對照組:采用 PBS代替一抗，濃度均為1∶100;陽性對照組:IGF-1、IGF-1R在大鼠的前列腺增生組織陽性表達(dá)標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有大鼠購買后在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，適應(yīng)3 d后去勢組SD大鼠在麻醉藥（10%水合氯醛按0.3 ml/100 g的劑量）經(jīng)腹腔注射麻醉下，在無菌手術(shù)臺上行雙側(cè)睪丸切除術(shù)。各非去勢組只麻醉后剪開外陰皮膚后立即縫合，作假手術(shù)處理。所有手術(shù)組術(shù)后3 d內(nèi)應(yīng)用抗生素（左氧氟沙星）預(yù)防感染，按照分組分別給予不同劑量丙酸睪丸酮皮下注射，按上述喂養(yǎng)條件持續(xù)喂養(yǎng)40 d，建立前列腺增生模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d停止睪酮注射，所有大鼠稱重。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 前列腺濕重及前列腺指數(shù) 用頸椎脫臼法處死大鼠，解剖前列腺，分離取出前列腺并用濾紙吸干血跡，用 PL403精密分析天平 （精確度為0.001 g）稱重，計(jì)算大鼠前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)=前列腺濕重（mg）/大鼠體重（g）。

1.3.2 前列腺組織HE染色 將前列腺組織放入福爾馬林溶液中固定24 h，進(jìn)行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片，厚度為4 μm，用蘇木精－伊紅染色，在MIAS 2000型圖像分析系統(tǒng)下觀察大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，每次3 min;然后將切片浸入0.01 mol的構(gòu)椽酸鹽緩沖液（pH6.0）中，用微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后再加熱，反復(fù)2次;冷卻后用PBS液（pH=7.2～7.4）洗滌3次，每次3 min;甩去水分后加一抗，4℃過夜;PBS液沖洗3次，每次3 min，甩去水分后滴加二抗;37℃孵育20 min，用PBS洗3次，每次5 min;按說明書操作使用 DAB顯色試劑盒顯色，顯微鏡觀察控制反應(yīng)時(shí)間在30 s，蒸餾水洗滌后復(fù)染，依次按 70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脫水各3 min，二甲苯透明，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.4 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 每張切片選擇5個(gè)視野，IGF-1、IGF-1R定位于前列腺上皮的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，以黃色或棕黃色染色信號為陽性標(biāo)準(zhǔn)，具體方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)按照SP試劑盒說明書進(jìn)行，以IGF-1、IGF-1R平均光密度值作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示;兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。用t檢驗(yàn)比較IGF-1和IGF-1R在不同組大鼠前列腺之間的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 A組和B組大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)

2.1.1 未去勢大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)的比較 兩組中，大鼠體重均有所增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B1組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)增加較A1組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 未去勢大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)的比較（n=5，±s）

表1 未去勢大鼠體重、前列腺濕重和前列腺指數(shù)的比較（n=5，±s）

指標(biāo) A1組 B1組 t值 P值體重（g）263.400 ±40.290 328.800 ±52.323 2.214 0.058前列腺濕重（mg） 0.277 ±0.033 1.058 ±0.264 6.567 ＜0.001前列腺指數(shù)0.106 ±0.010 0.326 ±0.083 5.921 0.004

2.1.2 去勢大鼠皮下注射不同劑量睪酮后體重和前列腺指數(shù)的變化情況 去勢大鼠中，注射不同劑量丙酸睪酮后，大鼠前列腺的體重及前列腺指數(shù)均有所增加，高脂高糖飲食組較普通飲食組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在皮下注射生理鹽水和2 mg/kg中，高脂組與普食組相比體重（t=2.807，P=0.038;t=4.483，P=0.003）和前列腺指數(shù)（t=4.344，P=0.007;t=4.032，P=0.010）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在5 mg/kg組，高脂組與普食組相比體重差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.087，P=0.034），而前列腺指數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.148，P=0.289）。普食組，皮下注射睪酮各劑量組之間去勢大鼠體重和前列腺指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.194、48.733，P ＜0.001）;高脂組，皮下注射睪酮各劑量組之間去勢大鼠體重和前列腺指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.872，P=0.037;F=19.108，P=0.001）。見圖 1。

2.2 前列腺組織結(jié)構(gòu)的病理改變 A1組前列腺無明顯增生，腺上皮呈單層柱狀或立方樣改變，管腔擴(kuò)大不明顯，分泌物染色呈粉紅色改變;A2組前列腺腺體無增生，管腔無擴(kuò)大;A3組大鼠前列腺腺體的體積明顯增大，腺體呈乳頭樣增生，腺泡增多，管腔分泌亢進(jìn)，見大量深粉紅色分泌物，有的形成前列腺凝結(jié)物;A4組大鼠前列腺腺體前列腺輕度增生，見單層柱狀上皮改變，管腔輕度增大，分泌物染色呈粉紅色。B組較A組相同處理?xiàng)l件下前列腺腺體增生更加活躍。見圖2。

2.3 前列腺組織結(jié)構(gòu)的免疫組織化學(xué)改變 IGF-1在前列腺增生組中平均光密度值為 （0.277±0.005），正常前列腺組織中平均光密度值為 （0.212±0.007），前列腺增生組織明顯高于正常前列腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=16.468，P＜0.001）;IGF-1R在前列腺增生組中平均光密度值為 （0.251±0.005），正常前列腺組織中平均光密度 （0.206±0.006），前列腺增生組織明顯高于正常前列腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=13.387，P＜0.001）。IGF-1主要在前列腺腺管的腺上皮細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，較均勻。IGF-1R主要在前列腺腺管的腺上皮細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，細(xì)胞間質(zhì)中可見少量彌散的陽性表達(dá)。見圖3。

3 討論

隨著我國人口老齡化的加劇、飲食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)生前列腺增生的危險(xiǎn)性明顯增加，因此研究前列腺增生的發(fā)生機(jī)制及預(yù)防措施對提高老年人生活質(zhì)量尤為重要。本實(shí)驗(yàn)成功建造了SD大鼠前列腺增生模型，大鼠前列腺出現(xiàn)了不同程度體積增大，腺體增生，管腔分泌亢進(jìn)等表現(xiàn)。這同孫俊英 等［3］研究一致，而研究［4－6］顯示，胰島素抵抗導(dǎo)致的高胰島素血癥，可以通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)促進(jìn)兒茶酚胺的釋放，減緩細(xì)胞的凋亡引起前列腺增生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［5］顯示使用胰島素增敏劑改善胰島素抵抗可縮小高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠前列腺體積，說明高脂飲食能導(dǎo)致胰島素抵抗，胰島素抵抗能引起高胰島素血癥，進(jìn)而促進(jìn)前列腺增生。由此可見，胰島素抵抗及高胰島素血癥是連接高脂高糖飲食及前列腺增生的重要病因?qū)W紐帶。

前列腺組織的正常生理狀態(tài)依賴于前列腺細(xì)胞增殖及凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡被外部因素打破，前列腺上皮細(xì)胞的增殖速度超過凋亡速度，前列腺表現(xiàn)腺體增生。雄激素是調(diào)控前列腺生長的重要激素，可以通過芳香酶作用轉(zhuǎn)化為雌激素，也可以通過促進(jìn)生長因子的分泌共同促進(jìn)前列腺增生。杜傳策等［7］發(fā)現(xiàn)雌二醇可以增加前列腺組織對雙氫睪酮的吸收和轉(zhuǎn)化，雌激素還能促進(jìn)雄激素與雄激素受體的結(jié)合，促進(jìn)前列腺增生。人體內(nèi)雌、雄激素水平處于一種平衡狀態(tài)，共同調(diào)節(jié)前列腺的生長發(fā)育、增殖和凋亡，無論是雌激素的增加還是雄激素的減少都會導(dǎo)致雌/雄激素比例增高，進(jìn)而導(dǎo)致的發(fā)生［8］。陳金海 等［9］發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高雌/雄激素比值相對于低雌/雄激素比值更能明顯促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖并減少細(xì)胞的凋亡。研究［10］顯示高雌/雄激素比值組大鼠前列腺基質(zhì)明顯增生，說明平衡狀態(tài)下的雌、雄激素比例被打破后表現(xiàn)為前列腺基質(zhì)細(xì)胞的過度增殖。由于青年人睪丸功能正常，體內(nèi)雄激素水平過高，雌雄激素相互“抑制”，達(dá)到一種平衡狀態(tài)，老年男性由于臟器的自然衰老及下丘腦－垂體－睪丸軸功能減退，體內(nèi)睪酮水平隨年齡的增加而逐漸下降，從而雌/雄激素比值增高，導(dǎo)致前列腺基質(zhì)細(xì)胞過度增殖，最終發(fā)展為前列腺增生。楊佳佳等［11］通過研究80例男性性腺功能減退合并代謝綜合征的患者發(fā)現(xiàn)，給予補(bǔ)充小劑量睪酮后患者肥胖、血脂、空腹血糖及胰島素敏感指數(shù)均明顯改善，說明小劑量睪酮替代治療能改善患者代謝癥狀，進(jìn)而延緩前列腺增生的進(jìn)展。

研究［12］顯示一些生長因子在前列腺增生過程中也起到重要的作用，IGF-1與IGF-1R是胰島素樣生長因子家族蛋白 （IGFs）中兩個(gè)重要的多肽蛋白，IGF-1在體內(nèi)主要由肝臟產(chǎn)生，廣泛的存在于機(jī)體組織中。研究［13］顯示 IGF-1主要位于前列腺基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而 IGF-1R主要位于前列腺腹側(cè)的膜上皮細(xì)胞，通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌途徑作用于組織細(xì)胞，IGF-1R是一種跨膜的酪氨酸激酶蛋白，是 IGFs系統(tǒng)的主要介導(dǎo)者，IGF-1在上皮組織中具有較強(qiáng)的促有絲分裂作用，IGF-1與其受體（IGF-1R）結(jié)合，通過激活PI3/AKT和MAPK途徑，促進(jìn)RNA和 DNA的合成，轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮促進(jìn)有絲分裂、細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡的作用［14］。研究［15］顯示高水平的 IGF-1在前列腺的生長發(fā)育有重要作用，研究［13］顯示雄激素受體的活性可能受到其他信號的控制，如IGF-1可以直接激活雄激素受體或增強(qiáng)雄激素受體核易位，表明IGF-1可以作為去勢后的雄激素替代治療。

本研究顯示高脂高糖飲食能誘發(fā)大鼠前列腺增生，去勢后給予低劑量外源性睪酮補(bǔ)充也能誘導(dǎo)大鼠前列腺增生，因此老年男性適當(dāng)控制高脂高糖飲食量并給予補(bǔ)充適量外源性睪酮，可以使老年人體內(nèi)雌雄激素比值保持平衡狀態(tài)，可以預(yù)防前列腺增生的發(fā)生，并猜想前列腺增生的發(fā)生可能與高脂高糖飲食引起的高胰島素血癥通過直接作用于前列腺細(xì)胞以及改變IGF信號通路各因子表達(dá)及活性有關(guān)，因此可以用IGF-1、IGF-1R作為前列腺增生的預(yù)測指標(biāo)和早期診斷指標(biāo)，以IGF-1、IGF-1R為共同靶點(diǎn)阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提供前列腺增生治療的新途徑。

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Expression of IGF-1 and IGF-1R in SD rat prostate tissue

Xiong Yu，Huang Tao，Wu Kui，et al
（Dept of Urology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

ObjectiveTo study different diet and testosterone propionate on SD rat prostatic tissue changes and insulin-like growth factor（insulin-like growth factor，IGF）-1，IGF-1R expression of strength.MethodsHigh fat and high-sugar diet after subcutaneous injection of testosterone propionate castrated prostatic hyperplasia model construction.All were killed 40 days later，removed the prostate tissue，weighed and HE staining prostatic hyperplasia cases were detected by immunohistochemistry in prostate tissue IGF-1，IGF-1R expression intensity.ResultsHigh fat and high sugar diet group prostatic hyperplasia and IGF-1，IGF-1R expression intensity was higher than normal diet group（P＜0.05）;high fat and high-sugar diet and low-dose subcutaneous injection of testosterone propionate group obviously prostate hyperplasia，IGF-1，IGF-1R expression intensity were significantly increased（P＜0.05）.ConclusionHigh-fat and high-sugar diet low dose of exogenous testosterone supplements can promote the proliferation of rat prostate tissue，IGF-1，IGF-1R and the development of benign prostatic hyperplasia are positively correlated.

high-fat and high-sugar diet;testosterone;prostate index;benign prostatic hyperplasia;IGF-1;IGF-1R

R 697.32

A

1000－1492（2015）09－1247－05

2015－03－31接收

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號:1408085QH152）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立臨床學(xué)院1泌尿外科、2病理科，合肥 230001

熊 宇，男，碩士研究生;

吳 奎，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:wukuimnwk@sohu.com