高血脂高膽紅素對(duì)IE－HPLC法檢測(cè)糖化血紅蛋白干擾的評(píng)價(jià)＊

蕭金麗，張秀明，徐勝男，索明環(huán)，徐全中，陳亞瓊，吳劍楊，李 曼，闞麗娟，溫冬梅

（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山528403）

2010年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)（ADA）發(fā)布的糖尿病治療準(zhǔn)則中，正式將糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%作為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，5.7%～6.2%為糖尿病高危人群，≥9.5%為糖尿病并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HbA1c測(cè)定作為糖尿病流行病學(xué)和監(jiān)測(cè)糖尿病長(zhǎng)期治療效果的重要指標(biāo)，近年來備受關(guān)注［1－2］。因此，在充分肯定HbA1c診斷糖尿病的優(yōu)越性的同時(shí)，客觀地闡明HbA1c在實(shí)際臨床應(yīng)用中的缺陷同樣很有必要，這對(duì)于HbA1c更好地應(yīng)用于臨床具有重要的意義［3］。本研究參考美國(guó)國(guó)家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（NGSP）認(rèn)證的Ⅰ級(jí)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)，以美國(guó)Primus Ultra2糖化血紅蛋白分析儀硼酸鹽親和層析高效液相色譜法（AC－HPLC）為對(duì)照系統(tǒng)［4－6］，與美 國(guó)Bio－Rad VariantⅡ糖化血紅蛋白分析儀離子交換高效液相色譜法（IE－HPLC）HbA1c檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，探討高血脂和高膽紅素對(duì)IE－HPLC的影響。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 全血標(biāo)本來源于2012年5月至2013年10月中山市人民醫(yī)院的住院、門診患者或健康體檢者。收集當(dāng)天新鮮EDTA－K2抗凝全血標(biāo)本，－70 ℃保存。將收集的新鮮EDTA－K2抗凝全血標(biāo)本分成4組：對(duì)照組（HbA1c＜6.2%）、糖尿病組（HbA1c≥6.2%）、高血脂組（TG 3～20mmol／L）、高膽紅素組（TBIL 21～549μmol／L）［7］。對(duì)照組標(biāo)本來自本院康體保健中心體檢的40例健康成年人，無渾濁、無血紅蛋白變異體、無高膽紅素、無高血脂。糖尿病組標(biāo)本來源于本院確診的2型糖尿病患者，無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，無高膽紅素、高血脂，同時(shí)排除尿毒癥和慢性腎衰的患者，共40例；糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合世界衛(wèi)生組織（WHO）1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)。高膽紅素組標(biāo)本來自本院住院或門診患者，TBIL≥21μmol／L；無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，患者無高血脂、尿毒癥，共40例。高血脂組來自本院住院、門診患者或健康體檢者，TG≥3mmol／L；無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，無高膽紅素，患者無尿毒癥，共40例。各組標(biāo)本來源患者的一般資料見表1（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)Primus Ultra2糖化血紅蛋白分析儀采用硼酸鹽AC－HPLC 檢測(cè)，美國(guó)Bio－Rad VariantⅡ糖化血紅蛋白分析儀采用IE－HPLC 檢測(cè)進(jìn)行比較分析，采用各檢測(cè)儀器配套的試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和耗材。

1.3 方法

1.3.1 儀器校準(zhǔn) 采用新鮮全血校準(zhǔn)的方法，一致性測(cè)定數(shù)據(jù)見文獻(xiàn)［8］。參照NGSP能力驗(yàn)證方法，檢測(cè)健康對(duì)照組40份標(biāo)本，每天檢測(cè)8份，連續(xù)測(cè)定5d。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 參照CLSI EP9－A 文件［9］，實(shí)現(xiàn)2個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果的一致性后，參照相關(guān)文獻(xiàn)［5－7］，所有檢測(cè)HbA1c的方法中以硼酸鹽AC－HPLC 最不受干擾，故以Primus Ultra2作為對(duì)照系統(tǒng)，Bio－Rad VariantⅡ?yàn)閷?shí)驗(yàn)系統(tǒng)，分別檢測(cè)糖尿病組、高膽紅素組和高血脂組標(biāo)本，每天檢測(cè)8份，連續(xù)測(cè)定5d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

1.4.1 使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。參照NGSPⅠ級(jí)實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)［10］，對(duì)兩種檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸分析和偏差（%）分析，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)差值的95%置信區(qū)間（95%CI）差異在參考系統(tǒng)的±0.70范圍內(nèi)以及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與對(duì)照系統(tǒng)偏差小于6%作為檢測(cè)結(jié)果可比的2項(xiàng)可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2 使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢測(cè)結(jié)果的組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，采用直線回歸相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組的比對(duì) 經(jīng)新鮮全血校準(zhǔn)后，對(duì)2臺(tái)儀器進(jìn)行對(duì)照組標(biāo)本的比對(duì)試驗(yàn)。以Primus Ultra2 的測(cè)定值為Y，Bio－Rad Variant Ⅱ的測(cè)定值為X，直線回歸方程為Y ＝0.959 4 X＋0.205 3，r＝0.993，差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P ＝0.795）；95%CI：－0.20～0.15，符合在±0.70范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；偏差（%）為－0.20%～0.30%符合偏差小于6%的標(biāo)準(zhǔn)。見圖1、2（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

2.2 異常組的比對(duì) 用2臺(tái)儀器分別測(cè)定糖尿病組、高膽紅素組和高血脂組3組標(biāo)本并作直線回歸分析。3組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均大于0.95說明結(jié)果分布范圍符合要求。當(dāng)HbA1c≤18.7%時(shí)IE－HPLC 檢測(cè)HbA1c相關(guān)系數(shù)r＝0.993，95%CI為－0.71～0.89，偏差（%）為－5.8%～6.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.198）。當(dāng)HbA1c＜16.3%時(shí)IE－HPLC 檢 測(cè)HbA1c相關(guān)系數(shù)r＝0.997，95%CI 為－0.31～0.67，偏差（%）為－5.8%～4.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），無明顯干擾；當(dāng)HbA1c為16.3%～18.7%時(shí)結(jié)果出現(xiàn)正偏倚。當(dāng)TG≤20.78mmol／L時(shí)IE－HPLC檢測(cè)HbA1c結(jié)果相關(guān)系數(shù)r＝0.995；95%CI 為－0.26～0.50；偏差（%）為－5.5%～5.8%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000），結(jié)果無明顯干擾。當(dāng)TBIL≤549.3μmol／L時(shí)，用IE－HPLC檢測(cè)HbA1c，相關(guān)系數(shù)r＝0.990；95%CI 為－0.08～0.63；偏差（%）為－14%～4.1%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。當(dāng)TBIL≤342.1 μmol／L IE－HPLC檢測(cè)HbA1c，相關(guān)系數(shù)r＝0.994；95%CI為－0.09～0.50；偏差（%）為－5.5%～4.1%；結(jié)果無明顯干擾；當(dāng)TBIL為380.7～549.3μmol／L 時(shí)結(jié)果出現(xiàn)負(fù)偏倚。見表2及圖3～6（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

表2 Bio－Rad VariantⅡ與Primus Ultra2兩系統(tǒng)檢測(cè)HbA1c的直線回歸分析和偏差分析

3 討 論

2013年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）公布，中國(guó)糖尿病的患病人數(shù)為9 840萬，居全球首位，同時(shí)根據(jù)IDF 估計(jì)，到2035年中國(guó)的糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到1.43 億。HbA1c作為首選診斷指標(biāo)，與FBG 和OGTT 相比，檢測(cè)便捷、可任意時(shí)間采血，準(zhǔn)確性、可重復(fù)性高，是一個(gè)宏觀的控制指標(biāo)。在過去的20多年中，HbA1c檢測(cè)主要用于糖尿病控制、治療效果評(píng)價(jià)以及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，從“評(píng)估指標(biāo)”發(fā)展到“診斷指標(biāo)”，體現(xiàn)出HbA1c在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)和價(jià)值［4］。但目前我國(guó)HbA1c的檢測(cè)結(jié)果一致性現(xiàn)狀與臨床要求尚存在差距。國(guó)內(nèi)各臨床實(shí)驗(yàn)室分析儀器種類較多，采用的試劑來源較多，檢測(cè)性能、試劑規(guī)格、分析參數(shù)亦各不相同。這些原因使不同實(shí)驗(yàn)室間的檢測(cè)結(jié)果存在差異，不具有可比性，給臨床應(yīng)用帶來不便［11］。多種因素可影響HbA1c檢測(cè)，其中疾病狀態(tài)，如高脂血癥、高膽紅素血癥都會(huì)干擾HbA1c檢測(cè)［4］。并且臨床醫(yī)生在解讀HbA1c結(jié)果時(shí)，HbA1c變化值超過0.5%時(shí)醫(yī)生就有可能改變治療方案，不準(zhǔn)確的結(jié)果會(huì)造成對(duì)患者病情的誤判或延誤治療。本研究旨在分析高血脂和高膽紅素對(duì)HbA1c的檢測(cè)造成的影響。

IE－HPLC是根據(jù)HbA1c與HbA0的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離。葡萄糖與Hb的β鏈N 未端Val連接降低了等電點(diǎn)，導(dǎo)致糖化Hb帶的正電荷比未糖化Hb的少，與樹脂的附著力小，可以分別用不同離子濃度的緩沖液在不同的時(shí)間將Hb從陽(yáng)離子交換柱中洗脫下來，再根據(jù)每個(gè)峰值下的面積來計(jì)算HbA1c占總Hb的比例［12］。常規(guī)的離子交換HPLC 法經(jīng)過多年技術(shù)上的改進(jìn)，檢測(cè)精密度、分辨率及抵抗多種糖化血紅蛋白變異體的能力有了明顯提高，基本可以達(dá)到臨床需求，但是還存在眾多干擾因素［13］。

本研究表明：人體內(nèi)的HbA1c＜16.3%時(shí)IE－HPLC 檢測(cè)HbA1c相關(guān)系數(shù)r＝0.997；95%CI 為－0.31～0.67；偏差（%）為－5.8%～4.3%結(jié)果無顯著干擾。隨著HbA1c濃度增加，正干擾逐漸遞增。當(dāng)TG≤20.78mmol／L 時(shí)IE－HPLC 檢測(cè)HbA1c結(jié)果相關(guān)系數(shù)r＝0.995；95%CI 為－0.26～0.50；偏差（%）為－5.5%～5.8%結(jié)果無顯著干擾。TBIL≤342.1 μmol／L對(duì)IE－HPLC檢測(cè)HbA1c相關(guān)系數(shù)r＝0.994；95%CI為－0.09～0.50；偏差（%）為－5.5%～4.1%結(jié)果無顯著干擾，隨著膽紅素濃度增加，負(fù)干擾逐漸遞增，與廠家聲明干擾因素及本課題組前期外源性高血脂高膽紅素對(duì)HbA1c的干擾相一致［14］。

在日常工作中，實(shí)驗(yàn)室工作人員面對(duì)復(fù)雜多樣標(biāo)本，要在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出正確結(jié)果，需要每個(gè)從業(yè)者了解每種HbA1c檢測(cè)原理，能根據(jù)患者本身情況選擇更合適的檢測(cè)HbA1c的方法。

［1］王麗娟，紀(jì)立農(nóng).國(guó)際專家委員會(huì)關(guān)于糖化血紅蛋白檢測(cè)在糖尿病診斷中的作用的報(bào)告［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2009，17（8）：563－568.

［2］陸祖謙，許樟榮.糖化血紅蛋白在糖尿病診斷中的作用［J］.中國(guó)糖尿病雜志，2009，17（8）：579－582.

［3］李婭，宋宇，段勇.糖化血紅蛋白檢測(cè)的局限性［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（6）：501－504.

［4］Roberts WL，F(xiàn)rank EL，Moulton L，et al.Effects of nine hemoglobin variants on five glycohemoglobin methods［J］.Clin Chem，2000，46（4）：569－572.

［5］Little RR，Vesper H，Rohlfing CL，et al.Validation by a mass spectrometric reference method of use of boronate affinity chromatography to measure glycohemoglobin in the presence of hemoglobin S and C traits［J］.Clin Chem，2005，51（1）：264－265.

［6］Little RR，Rohlfing CL，Hanson S，et al.Effects of hemoglobin（Hb）E and HbD traits on measurements of glycated Hb（HbA1c）by 23methods［J］.Clin Chem，2008，54（8）：1277－1282.

［7］Holownia P，Bishop E，Newman DJ，et al.Adaptation of latexenhanced assay for percent glycohemoglobin to a Dade Dimension？analyzer［J］.Clin Chem，1997，43（1）：76－84.

［8］溫冬梅，張秀明，吳劍楊，等.新鮮全血賦值傳遞實(shí)現(xiàn)不同HbA1c檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果的溯源性和可比性［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2014，32（10）：790－792.

［9］Clinical Laboratory Standard institute.EP9－A2 Method comparison and bias estimation using patient samples［S］.Wayne，PA，USA：CLSI，2002.

［10］Nationnal Glycohemoglobin Standardization Program.NGSP：HbA1cassay interferences［EB／OL］.［2014－11－24］.http：／／www.ngsp.org／interf.asp.

［11］吳炯，邵文琦，周琰，等.上海地區(qū)糖化血紅蛋白一致性計(jì)劃建立和結(jié)果初步評(píng)價(jià)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（4）：370－372.

［12］宋智心，徐國(guó)賓，馬懷安，等.糖化血紅蛋白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（6）：497－500.

［13］居漪.糖化血紅蛋白檢測(cè)技術(shù)和質(zhì)量控制［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25（11）：914－917.

［14］陳穎，溫冬梅，張秀明，等.四種方法檢測(cè)糖化血紅蛋白的干擾性能評(píng)價(jià)［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2013（10）：786－787.