苯巴比妥聯(lián)合CCl4法建立肝硬化腹水大鼠模型

方 慶，王成業(yè)，姚 瑤，王滿媛，許 釩

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽合肥 230038;3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051)

肝臟是人體代謝的中樞器官，起著調(diào)節(jié)能量、蛋白質(zhì)、氨基酸等代謝重要作用。肝硬化是由一種或多種病因長(zhǎng)期、反復(fù)刺激而引起的慢性肝病，肝硬化早期肝臟處于代償期，而腹水則是肝硬化由代償期向失償期進(jìn)展的重要標(biāo)志之一。肝硬化腹水是威脅人類健康的常見疾病，目前尚沒有理想的治療方式。肝硬化腹水動(dòng)物模型的建立是肝病研究中重要一環(huán)，建立理想的肝硬化腹水動(dòng)物模型不僅是進(jìn)行此類疾病實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，也是臨床評(píng)價(jià)肝硬化腹水診斷和治療方法的有效手段之一［1－5］。

理想的肝硬化動(dòng)物模型應(yīng)具備如下條件:與人類肝硬化、門脈高壓的特征相同、造模成功率高、死亡率低、周期短、方法簡(jiǎn)便易行、所用造模因素對(duì)人體無害或較少危害，環(huán)境污染小等。目前，復(fù)制肝硬化腹水動(dòng)物模型的方法主要有:CCl4法、乙醇法、免疫法、膽管結(jié)扎法、復(fù)合造模法等。無論是單因素法還是復(fù)合因素造模法，復(fù)制穩(wěn)定、成功率高的動(dòng)物模型仍存在一定的難度。

綜合相關(guān)文獻(xiàn)［6－7］及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)造模方法的摸索，本研究采用苯巴比妥聯(lián)合CCl4法復(fù)制肝硬化腹水大鼠模型。35%苯巴比妥溶液誘導(dǎo)1周，激活肝臟肝藥酶P450活性，第2周開始，按梯度腹腔注射CCl4油溶液，每周2次至第14周。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至中后期，收集大鼠24 h尿液，測(cè)量尿量;檢查腹腔積液量;肝組織HE染色觀察肝臟病理進(jìn)程。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重(200±20)g，由江蘇南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，合格證號(hào):SCXK(蘇)2009－0001。

1.2 試劑 CCl4(分析純):江蘇強(qiáng)盛化工有限公司(批號(hào)2008121);福臨門一級(jí)菜籽油:中糧東海糧油工業(yè)有限公司(批號(hào)20111010);甲醛(分析純):上海中試化工總公司(批號(hào)20100130);苯巴比妥片:上海信宜藥廠有限公司(國藥準(zhǔn)字H31022038);無水乙醚(分析純)，上海中試化工總公司批號(hào)(20101010)。

1.3 儀器 MP6001電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品);島津全自動(dòng)生化分析儀(Olympus，Japan);移液器(Eppendorf);HH.B11.260－TBS臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);TB－718生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(湖北孝感市泰維電子有限公司);LEICA RM2135封閉式切片機(jī)(湖北孝感市泰維電子有限公司);TK－218Ⅱ恒溫?cái)偲?、烤片機(jī)(湖北孝感市泰維電子有限公司);DP70數(shù)碼照相裝置(Olympus，Japan)。

1.3 溶液的配制

1.3.1 35%苯巴比妥CMC-Na混懸液配制 精密稱取50.0 g CMC-Na粉末，散入盛有蒸餾水的塑料水桶，邊加邊攪拌，加蒸餾水至10 L，室溫放置過夜，即得0.5%CMC-Na混懸液。

精密稱取10片(每片30 mg)苯巴比妥片，得平均片重0.066 56 g。取適量苯巴比妥片，研碎，稱7.765 3 g藥粉。將藥粉加入預(yù)先配制的 10 L 0.5%CMC-Na混懸液中，攪拌混勻，即得35%苯巴比妥CMC－Na混懸液。

1.3.2 CCl4油溶液的制備 CCl4油溶液的制備:移液器分別取 CCl41.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL加入菜籽油定容至10 mL即得。

1.4 動(dòng)物模型的建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除正常組給予蒸餾水作為飲用水外，其他各組大鼠第1周給予35%苯巴比妥CMC-Na混懸液(35 mg/100 mL)作為飲用水誘導(dǎo)1周。第2～3周腹腔注射10%CCl4油溶液，每周2次，劑量為0.1 mL/100 g，首次劑量加倍。第4～5周給予12%CCl4油溶液;第6～7周給予14%CCl4油溶液;第8～9周給予16%CCl4油溶液;第10～11周給予18%CCl4油溶液;第12～14周給予20%CCl4油溶液。從第四周開始，每隔2周，取2～3只動(dòng)物，對(duì)肝臟進(jìn)行病理檢測(cè)，觀察造模過程肝臟病理動(dòng)態(tài)變化。

1.5 成模標(biāo)準(zhǔn) (1)尿量明顯減少且與正常組相比差異有顯著性;(2)腹腔積液量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;(3)肝臟肉眼觀察見再生結(jié)節(jié)，肝臟組織切片觀察匯管區(qū)—匯管區(qū)或匯管區(qū)—中央靜脈纖維間隔互相擴(kuò)展和連接，分割肝小葉形成假小葉。

1.6 考察指標(biāo) (1)24 h尿量:將大鼠置于代謝籠內(nèi)，適應(yīng)飼養(yǎng)2 d后，收集大鼠24 h尿液，測(cè)量24 h尿量;(2)腹腔積液量:參考文獻(xiàn)方法［8］，于第14周末，大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，沿腹中線剪開3.0 cm，將規(guī)格為2.5 cm ×5.0 cm已稱重濾紙迅速塞入腹腔，3 min后濾紙充分吸收腹腔積液，取出，稱濾紙重，以兩次稱量之差計(jì)為腹腔積液重量。

1.7 肝組織HE染色 (1)取材:大鼠乙醚麻醉后，打開腹腔，從同葉肝臟剪取一塊大小為2.0 cm×2.0 cm ×0.5 cm的組織;(2)固定:將取下的肝、腎組織分別置10%福爾馬林溶液。脫水透明:將組織依次放入75%乙醇(1.5 h)→ 85%乙醇(1.5 h)→ 95%乙醇(2.5 h)→ 無水乙醇 I(30 min)→ 無水乙醇Ⅱ(30 min)→ 二甲苯I(15 min)→二甲苯Ⅱ(觀察至透明即可);(3)浸蠟包埋:將熔化的石蠟傾入包埋模具中，將組織埋入溶化的石蠟中，包埋模具放置在冷水中加速凝固，待石蠟?zāi)毯螅〕霭裣瀴K，修整成規(guī)則的正方型或長(zhǎng)方型。用石蠟切片機(jī)切片，厚度為4～6 μm。(4)脫蠟:載玻片浸入二甲苯I(10 min)→ 二甲苯Ⅱ(10 min)→二甲苯Ⅲ(10 min)→ 無水乙醇(2 min)→95%乙醇(2 min)→80%乙醇(2 min)→ 自來水沖洗;(5)染色:蘇木精浸染(5 min)→ 自來水洗→1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒 → 自來水洗→PBS藍(lán)化(2 min)→自來水洗→伊紅(1 min)→ 自來水洗;(6)脫水、透明:95%乙醇(1 min)→ 100%乙醇 I(1 min)→100%乙醇Ⅱ(3 min)→二甲苯I(5 min)→二甲苯Ⅱ(5 min)→二甲苯Ⅲ(5 min);(7)封片:在載玻片上加1～2滴中性樹膠，加蓋玻片封固，置于通風(fēng)櫥內(nèi)室溫干燥。待載玻片晾干后，于光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.0進(jìn)行分析，結(jié)果以“均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差±s)”表示，組間比較采用ANOVA分析。方差齊性，使用LSD法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結(jié)果

模型組40只SD大鼠肝硬化模型誘導(dǎo)14周共死亡4只，死亡率10.0%。模型組大鼠24 h尿量較正常組明顯減少;腹腔積液量顯著增多(見表1);病理HE染色結(jié)果顯示，模型組肝組織出現(xiàn)大量變性、壞死、形成纖維間隔，正常肝小葉被分割形成假小葉。HE染色表明，模型組大鼠肝硬化模型形成;尿量減少，腹腔積液增多，表明模型大鼠腹水形成，即肝硬化腹水模型復(fù)制成功。

表1 大鼠24 h尿量、腹腔積液量± s，n=10)

表1 大鼠24 h尿量、腹腔積液量± s，n=10)

注:與正常組比較1)P ＜ 0.05，2)P ＜ 0.01。

/g正常組組別 24 h尿量/mL 腹腔積液量25.38 ±6.19 0.2544 ±0.0577模型組 16.70 ±4.582) 0.3709 ±0.13481)

3 討論

肝硬化是一種常見的慢性肝病，可由一種或多種原因引起肝臟損害，組織學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞彌漫性變性壞死，繼而出現(xiàn)纖維組織增生和肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生，這三種改變反復(fù)交錯(cuò)進(jìn)行，結(jié)果肝小葉結(jié)構(gòu)和血液循環(huán)途徑逐漸被改建，使肝變形變硬而導(dǎo)致肝硬化，肝硬化腹水是其失償代謝期常見臨床表現(xiàn)之一，建立適合的肝硬化動(dòng)物模型，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。

苯巴比妥是典型的肝藥酶誘導(dǎo)劑，通過誘導(dǎo)肝藥酶P450等藥物代謝酶，提高肝臟的物質(zhì)代謝功能，可加促外源性物質(zhì)如藥物和內(nèi)源性物質(zhì)如NH3的生物轉(zhuǎn)化。

CCl4是廣泛用于建立肝硬化動(dòng)物模型的化學(xué)誘導(dǎo)劑，其特點(diǎn)為成模率高，重復(fù)性好，方法較為簡(jiǎn)單。其作用機(jī)制為CCl4經(jīng)肝門靜脈進(jìn)入肝臟，隨血液循環(huán)自匯管區(qū)流向中央靜脈區(qū)。在這此過程中，肝細(xì)胞吸收CCl4，肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素氧化酶P450被激活生成大量活性三氯甲基(CCl3－)，該自由基通過攻擊肝細(xì)胞膜的磷脂，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。另外，CCl3－還可與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，損傷線粒體，導(dǎo)致肝內(nèi)還原性輔酶A(NADH)和三磷酸腺苷(ATP)的合成減少，進(jìn)而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)［9］。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到損傷可導(dǎo)致脂蛋白合成發(fā)生障礙，使得三酰甘油和脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，造成脂肪變性、甚至凋亡。因此，采用低濃度CCl4反復(fù)刺激機(jī)體，可使肝組織經(jīng)“損傷—修復(fù)—損傷”的循環(huán)作用，從而造成肝臟的炎癥遷延，不斷形成纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生。通常，CCl4油溶液經(jīng)皮下注射，3～5 mL·kg－1，每周 2次，12～15周即可成模。CCl4誘導(dǎo)肝硬化模型，機(jī)制明確、效果肯定、重現(xiàn)性好、劑量可控，多見于模擬突發(fā)性肝功能衰竭、肝細(xì)胞脂肪變性導(dǎo)致的肝硬化。然而單純的CCl4刺激，會(huì)導(dǎo)致高死亡率，甚至多器官毒副反應(yīng)，從而限制了其在肝纖維化及肝硬化病理發(fā)生機(jī)制研究中的應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)造模期間大鼠死亡率與其體重有一定的關(guān)系:1周內(nèi)體重下降達(dá)20 g以上的大鼠腹腔注射CCl4容易死亡且腸系膜出現(xiàn)黏連，因此試驗(yàn)期間，每周定期稱量體重，若出現(xiàn)體重急劇下降即立即停止注射造模劑，待動(dòng)物狀態(tài)恢復(fù)后再繼續(xù)造模。這樣可以大大降低造模期間動(dòng)物的死亡率，從而達(dá)到提高造模的成功率。

本實(shí)驗(yàn)采用苯巴比妥聯(lián)合CCl4法復(fù)制肝硬化腹水模型。苯巴比妥為肝藥酶誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)肝細(xì)胞色素P450的合成，加速CCl4的在體內(nèi)代謝從而加重肝毒性，縮短了單純使用CCl4誘導(dǎo)肝硬化腹水的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中CCl4油溶液濃度呈梯度遞增，一方面降低了造模過程的死亡率，同時(shí)可對(duì)肝臟造成漸進(jìn)性的刺激，逐步加重肝損傷，使肝臟病理逐漸進(jìn)入肝硬化。

從苯巴比妥聯(lián)合CCl4法復(fù)制肝硬化腹水大鼠模型的方法的相關(guān)指標(biāo)來看，模型組大鼠肝臟病理檢查見假小葉形成，提示肝臟病變進(jìn)入肝硬化階段;尿量明顯減少，腹腔積液量顯著增加，表明腹水形成，即肝硬化腹水模型形成。

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