免疫傳感器在大腸桿菌O157：H7檢測(cè)中的研究進(jìn)展

徐金雷等

【摘 要】大腸桿菌O157：H7是一種典型的致病菌，嚴(yán)重感染后會(huì)引發(fā)敗血癥、腎功能衰竭等危及生命的并發(fā)癥，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等方面，都具有十分重要的意義。分析和評(píng)述了近年來(lái)采用免疫傳感手段對(duì)大腸桿菌O157：H7檢測(cè)的報(bào)道研究，技術(shù)主要分為阻抗式、壓電式、表面等離子體共振式、酶標(biāo)式、熒光標(biāo)記式、電導(dǎo)式、電致發(fā)光式，最后對(duì)其研究走向和應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

【關(guān)鍵詞】大腸桿菌O157：H7；免疫傳感器；檢測(cè)；綜述

【Abstract】Escherichia coli O157：H7 is a kind of typical pathogenic bacteria. Life-threatening complications including hematosepsis， renal failure will be leaded after severe infection. The detection of Escherichia coli O157：H7 have a very important significance in the food safety， medical and health， environmental protection and other aspects. This paper analyzed and reviewed recent reported research for detection of Escherichia coli O157： H7 by immune-sensing means. Immune-technologies mainly divided into impedance type， piezoelectric transducer type， surface plasmon resonance type， enzyme label type， fluorescent marker type， conductometric type， electrochemiluminescence type. Finally， the research study direction and application prospect are looked into the distance.

【Key words】Escherichia coli O157：H7； Immune sensor； Detection； Review

0 引言

大腸桿菌O157：H7對(duì)人的致病力較強(qiáng)，每克感染載體含菌10個(gè)以上即可能引起感染。嚴(yán)重感染大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7，E. coli O157：H7）后，會(huì)產(chǎn)生大量的Vero毒素，從而引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜等。因此，對(duì)E. coli O157：H7的預(yù)防和檢測(cè)，具有重要的意義。

常規(guī)實(shí)驗(yàn)室對(duì)E. coli O157：H7的鑒定、檢測(cè)依然停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清學(xué)分型水平，這些傳統(tǒng)的方法操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長(zhǎng)。免疫傳感器是由固定化的生物敏感材料作為識(shí)別元件與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析系統(tǒng)。具有特異、靈敏、高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，可以在物質(zhì)分子層面進(jìn)行快速、微量檢測(cè)，目前正成為一種強(qiáng)有力的通用分析工具。該文就免疫傳感技術(shù)在檢測(cè)E. coli O157：H7方面的最新進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，并展望該技術(shù)在致病菌檢測(cè)方面存在的難點(diǎn)與研究前景，期望對(duì)該領(lǐng)域的研究提供一定的參考價(jià)值。

1 檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的免疫傳感器

1.1 阻抗式

阻抗式免疫傳感器是通過(guò)檢測(cè)修飾電極的界面特性來(lái)分析樣品中E. coli O157：H7的一種方法。Barreiros等以ITO為基底，構(gòu)建特意識(shí)別E. coli O157：H7的傳感界面，實(shí)現(xiàn)了E. coli O157：H7的特異、靈敏檢測(cè)。檢測(cè)線(xiàn)性范圍為10～106 CPU/mL，檢測(cè)限達(dá)1 CPU/mL[1]。Wang等使用絲網(wǎng)印刷電極制備了可拋式、簡(jiǎn)易的E. coli O157：H7阻抗傳感器，檢測(cè)限為1.5×103 CFU/mL，線(xiàn)性范圍為1.5×103～1.5×107 CFU/mL[2]。該類(lèi)方法不需要標(biāo)記、且傳感器制備較簡(jiǎn)化，而得到廣泛研究，但該方法與傳統(tǒng)方法相比較其靈敏度偏低，實(shí)際樣品分析系統(tǒng)有待進(jìn)一步完善。

1.2 壓電式

壓電免疫傳感器依靠測(cè)量質(zhì)量的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的測(cè)定，即在生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中，壓電石英晶體表面被修飾、選擇性地與被檢測(cè)物質(zhì)作用，繼而在晶體表面出現(xiàn)異號(hào)極化電荷（又稱(chēng)壓電效應(yīng)），從而實(shí)現(xiàn)生物傳感器的檢測(cè)目的。Farka等有機(jī)結(jié)合石英晶體微天平的有效、被動(dòng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了E. coli的檢測(cè)，檢測(cè)限位8×104 CFU/mL[3]。Shen等研發(fā)了E. coli O157：H7的一種新型壓電檢測(cè)方法，使用了免疫磁珠技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間為4小時(shí)，在磷酸鹽緩沖溶液中的檢測(cè)限為23 CFU/mL，在牛奶中的檢測(cè)限為53 CFU/mL[4]。壓電生物傳感器的特點(diǎn)是樣品無(wú)需標(biāo)記、響應(yīng)靈敏、特異性高、簡(jiǎn)便快速、易于自動(dòng)化與集成化。

1.3 表面等離子體共振式

當(dāng)生物分子結(jié)合到金屬表面時(shí)，會(huì)引起表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）折射率及入射角的改變，因此通過(guò)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)過(guò)程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化，可以得到生物分子之間相互作用的特異性信號(hào)，以此來(lái)研究生物分子間的相互作用。Tokel等對(duì)SPR進(jìn)行了評(píng)述，并用于E. coli的檢測(cè)，檢測(cè)線(xiàn)性范圍1.0×105到3.2×107 CFU/mL[5]。Usachev等研制的SPR免疫傳感器，對(duì)溶液中E. coli的檢測(cè)限為15×103 CFU/mL，對(duì)應(yīng)空氣中的含量為219×104 CFU/mL[6]。SPR免疫傳感器的研究在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用已相對(duì)成熟，部分成品儀器已應(yīng)用到E. coli O157：H7的檢測(cè)。SPR 技術(shù)具有非破壞性、無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、靈敏度及選擇性高的優(yōu)點(diǎn)；但SPR傳感技術(shù)對(duì)于低濃度、小分子量的分子檢測(cè)精度不高。

1.4 酶標(biāo)式

Shen等采用免疫磁珠和細(xì)小金納米粒子構(gòu)建了增強(qiáng)型酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系，根據(jù)顏色變化，在磷酸鹽緩沖溶液中，對(duì)E. coli O157：H7的檢出限為68 CFU/mL，對(duì)食品中E. coli O157：H7的檢測(cè)線(xiàn)性為6.8×102到6.8×103 CFU/mL，是普通免疫磁珠分離基酶聯(lián)免疫檢出限的兩倍，比普通酶聯(lián)免疫檢測(cè)靈敏度提高了四倍，整個(gè)分析過(guò)程在3小時(shí)內(nèi)完成，為一種高效、靈敏的檢測(cè)方法[7]。Zhag等借助葡萄糖氧化酶、漆酶的雙重放大功能，研制了一種靈敏的檢測(cè)E. coli O157：H7的化學(xué)發(fā)光免疫傳感體系，借助產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，構(gòu)建魯米諾的發(fā)光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)E. coli O157：H7的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間小于2小時(shí)，線(xiàn)性區(qū)間為4.3×103 CFU/mL到4.3×105 CFU/mL，檢出限為1.2×103 CFU/mL，具有一定的推廣價(jià)值[8]。至今，酶標(biāo)法傳感器主要通過(guò)兩種方式實(shí)現(xiàn)，一是酶直接與底物作用產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)，二是借助酶產(chǎn)生的電信號(hào)。多數(shù)情況下，可以通過(guò)直接改變標(biāo)記底物獲得可檢測(cè)的信號(hào)（熒光、化學(xué)發(fā)光，電信號(hào)）。但是，標(biāo)記酶的穩(wěn)定性和活性保持能力有待發(fā)展，發(fā)展人工模擬酶在該領(lǐng)域的應(yīng)用，也是很好的發(fā)展方向之一。

1.5 熒光標(biāo)記式

近年來(lái)， 基于熒光標(biāo)記方法構(gòu)建的生物傳感器廣泛應(yīng)到致病菌的檢測(cè)中。Chen等以包裹熒光素的硅球?yàn)闃?biāo)記，借助熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀構(gòu)建了E. coli O157：H7的快速間接檢測(cè)系統(tǒng)，熒光顯微鏡可以檢測(cè)到1.0×105 cell/mL 的E. coli O157：H7；流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)到混合液中4.5×106 cell/mL 的E. coli O157：H7，并成功應(yīng)于啤酒中E. coli O157：H7的檢測(cè)[9]。Cho等借助免疫磁珠技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了E. coli O157：H7、傷寒沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增多性李司忒氏菌三種致病菌的原位熒光分別檢測(cè)，對(duì)食物樣品中致病菌的檢出限都約為5 CFU/mL[10]。熒光標(biāo)記由于快捷、便利、簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，在E. coli O157：H7的檢測(cè)應(yīng)用中，具有較好的發(fā)展前景。

1.6 電導(dǎo)式

Sarra等研究了一種基于電導(dǎo)信號(hào)的免疫傳感器，并成功用于E. coli和粘質(zhì)沙雷氏菌的檢測(cè)，檢測(cè)區(qū)別為1到103 CFU/mL[11]。Hnaiein等構(gòu)件了一種基于免疫磁性粒子的電導(dǎo)式E. coli檢測(cè)體系，該方法對(duì)E. coli具有較好的特異性，1 CFU/mL E. coli的變化可以產(chǎn)生35 mus電導(dǎo)檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)可達(dá)500 CFU/mL[12]。電導(dǎo)式免疫傳感器尚處于發(fā)展階段，存在較大的發(fā)展空間。

1.7 電致發(fā)光式

Leach等采用自動(dòng)化的電致發(fā)光系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)樣品中E. coli O157：H7的檢測(cè)，經(jīng)5 h的富集之后，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1 CFU/g，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在6.5 小時(shí)內(nèi)完成[13]。目前，電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物有限，且其穩(wěn)定性有待進(jìn)一步改善。

2 結(jié)論與展望

抗原-抗體特異識(shí)別E. coli O157：H7所建立的傳感器，統(tǒng)稱(chēng)為E. coli O157：H7免疫傳感器。其兩大主要部分就是識(shí)別元件和信號(hào)傳遞元件，根據(jù)信號(hào)源不同，主要分為免標(biāo)記直接檢測(cè)型和帶標(biāo)記間接檢測(cè)型兩類(lèi)。前者簡(jiǎn)單、花費(fèi)低，但靈敏度較低，限制了其應(yīng)用；而后者應(yīng)用相對(duì)較廣泛。與其它方法相比，免疫傳感器檢測(cè)E. coli O157：H7還處于起步階段，但是E. coli O157：H7免疫傳感器具備快速、靈敏、便攜、易操作的發(fā)展前景，決定了其在E. coli O157：H7檢測(cè)將占有一席之地。

生物傳感器作為一種發(fā)展中的檢測(cè)手段，各種分類(lèi)之間有其相互交叉的地方，因此可以通過(guò)不同方法與傳感器結(jié)合開(kāi)展研究，將多種方法相互融合、取長(zhǎng)補(bǔ)短實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的最終目標(biāo)：高通量、高靈敏、快速便攜、易操作。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使得快速、準(zhǔn)確檢測(cè)E. coli O157：H7成為可能，并為該領(lǐng)域的研究開(kāi)拓更廣闊的前景。

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