補骨脂醇提物對大鼠尿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

胡 超，湯響林，李　杰，梁乾德，王宇光，馬增春，肖成榮，譚洪玲，趙永紅，黃先菊，高　月（.中南民族大學(xué)藥學(xué)院生理與藥理教研室，湖北武漢430000；.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 00850）

補骨脂醇提物對大鼠尿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響

胡 超1，2，湯響林2，李杰2，梁乾德2，王宇光2，馬增春2，肖成榮2，譚洪玲2，趙永紅2，黃先菊1，高月2
（1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院生理與藥理教研室，湖北武漢430000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

目的 基于代謝組學(xué)的方法研究補骨脂醇提物（EEFP）對正常大鼠尿液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響。方法 雄性SD大鼠每天1次分別ig給予EEFP 0.54，1.08和1.62 g·kg-1，連續(xù)給藥2周，末次給藥后收集12 h尿液。應(yīng)用超高效液相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）分析尿液，MassLynx采集并處理數(shù)據(jù)，采用主成分分析（PCA）方法和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）方法，分析各組大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的差別，通過正交偏最小二乘法（OPLS-DA）、變量重要程度（VIP）和t檢驗篩選潛在生物標(biāo)志物并測定其相對含量。結(jié)果 PCA結(jié)果顯示，各組樣本點較好地聚合在一起，各EEFP給藥組與空白對照組互相完全分離，且與空白對照組之間的距離隨EEFP給藥劑量的增加而增大；EEFP 0.54，1.08和1.62 g·kg-1中對甲酚葡糖苷酸和半乳糖-β-1，4-木糖相對含量分別為40.0±11.2，2.7±2.6，16.8±6.3和45.9±16.4，32.6±22.1，8.0±8.3，明顯低于空白對照組的107.0±26.9和82.3±13.6（P＜0.01）；EEFP 1.08和1.62 g·kg-1中5-L-谷氨酰基-?；撬?、葡萄糖酸內(nèi)酯相對含量分別為22.4±10.0，47.6±19.1和138.2±18.8，337.3±64.0，明顯高于空白對照組的2.6±1.6和20.5±6.8（P＜0.01）；EEFP 1.62 g·kg-1組D-泛酸-L-半胱氨酸相對含量為74.2±31.5，明顯高于空白對照組的0.6±0.5（P＜0.01）；隨EEFP給藥劑量的增加，D-泛酸-L-半胱氨酸、5-L-谷氨?；??；撬岷推咸烟撬醿?nèi)酯含量呈升高的趨勢（P＜0.01），半乳糖-β-1，4-木糖和對甲酚葡糖苷酸含量呈下降的趨勢（P＜0.01）。結(jié)論 EEFP給藥2周后，大鼠尿內(nèi)源性物質(zhì)有顯著改變，與能量代謝、酪氨酸和牛磺酸代謝以及葡萄糖代謝有關(guān)。

補骨脂醇提物；代謝組學(xué)；生物標(biāo)志物；尿

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.009

中藥補骨脂（Fructus Psoraleae）為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，其味辛、苦、溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉之功效，歷代中醫(yī)用于腎虛、冷瀉、遺滑精、小便頻數(shù)、腰膝冷痛；外治用于皮膚病和白癜風(fēng)等［1］。補骨脂的主要藥效成分包括補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚，而這些成分主要存在于醇提部位中［2］。補骨脂及其復(fù)方長期超劑量服用存在一定的毒性，包括肝毒性［3］和視網(wǎng)膜毒性［4］。

中藥由于其成分復(fù)雜，多靶點作用于機體的特性，從而對其藥效和毒性機制的研究帶來了一定的難度。近代研究表明，代謝組學(xué)在中藥成分及中藥作用機制的研究中顯示出優(yōu)越性［5-6］。本研究采用基于超高效液相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultraperformance liquid chromatography/quadrupole-timeof-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）代謝組學(xué)的方法，研究補骨脂醇提物（ethanol extract of Fructus Psoraleae，EEFP）連續(xù)灌胃2周后，對大鼠尿液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響，并尋找潛在生物標(biāo)志物，為進一步闡釋補骨脂的藥效和毒效機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

補骨脂（產(chǎn)于甘肅，批號：133229），經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院馬百平教授鑒定為Fructus Psoraleae，乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），水（純凈水，中國哇哈哈公司），甲酸（色譜級，德國Mreda Technology公司），羧甲纖維素鈉（MCCNa，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

Acquity UPLC-Synapt MS色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國 Watrers公司）、冷凍離心機（Heraeus Labofuge 400R，美國Thermo Scientific公司）、旋蒸儀（Basis Hei-VAP ML，德國Heidolph公司）。

1.2 補骨脂醇提物的制備

采用70%乙醇滲漉提取，稱取補骨脂藥材4.188 kg，置于滲漉筒中，加入2倍量70%乙醇浸泡12 h，以32 mL·min-1的速度滲漉，收集15倍量滲漉液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，得稠浸膏931 g，提取率為22.23%。通過UPLC-Q-TOF-MS獲得其指紋圖譜并鑒定其主要活性成分。

1.3 動物分組及給藥

SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2012-0004。大鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院SPF級動物房中，適應(yīng)1周后，隨機分為空白對照組和EEFP 0.54，1.08和1.62 g·kg-1組（分別相當(dāng)于成人給藥劑量的2，4和6倍）。藥物用1%CMCC-Na懸浮，給藥方式為灌胃，給藥體積為5 mL·kg-1，每天ig 1次，連續(xù)給藥2周。

1.4 尿液采集與處理

末次灌胃后，將大鼠置于代謝籠中，收集12 h尿液，5 353×g離心10 min，分別取1 mL上清液于EP管中，加入20 μL疊氮鈉，置于－80℃冰箱中保存。

實驗前，取出樣品常溫下解凍。各取500 μL解凍后的樣本，加入100 μL的乙腈，渦旋混勻，靜置1 min，4℃下16 060×g離心15 min，取上清液經(jīng)微孔濾膜濾過后進樣。

1.5 質(zhì)控樣品的制備

從所有樣品中分別取100 μL混勻，取500 μL混合液按1.4中方法處理即得質(zhì)控樣品（quality control，QC）。QC樣品于樣品分析前進樣1次，然后每隔6個樣品進樣1次，一共進樣5針。

1.6 色譜質(zhì)譜條件

流動相：0.1%甲酸水溶液（A），0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速：0.5 mL·min-1，進樣量：5 μL，柱溫：30℃，運行20 min，洗脫條件如下：0～1 min（2% B），1～2 min（2%～5%B），2～5 min（5%～12%B），5～10 min（12%～20%B），10～12 min（20%～30% B），12～13 min（30%～50%B），13～15 min（50%～100%B），15～16 min（100%B），16～17 min（100%～2%B），17～20 min（2%B）。

采用電噴霧電離離子源，參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓為3.0 kV（ES+）、2.9 kV（ES－），脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速900 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1。通過MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站采集數(shù)據(jù)和輸出數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將所得樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerLynx XS處理，采用無監(jiān)督模式識別方法即主成分分析法（principal component analysis，PCA）和監(jiān)督模式識別方法即偏最小二乘判別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）分析，通過正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）的得分圖可形象的觀察到空白組與各給藥組尿液成分的分布情況及差異，選擇變量重要程度（variable importance in the projection，VIP）＞3的變量進行t檢驗，在95%的置信度下變量內(nèi)空白對照組與給藥組具有顯著性差異（P＜0.5）的變量為有效信號。

1.8 標(biāo)志物的鑒別

將處理得到的有效信號與自建數(shù)據(jù)庫（由梁乾德博士建立）匹配，過濾掉外源性物質(zhì)的信息，保留內(nèi)源性物質(zhì)的信息，再通過查找HMDB和KEGG在線數(shù)據(jù)庫，比對質(zhì)荷比、保留時間及質(zhì)譜圖，初步確定可能的生物標(biāo)志物結(jié)構(gòu)信息。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 補骨脂醇提物指紋圖譜及主要成分鑒定

圖1 A和B分別為EEFP的全波長紫外（photo diode array，PDA）圖及正離子模式下的總離子流圖（total ion chromatograms，TIC），4種主要活性成分的一級質(zhì)譜圖如圖1C，D，E，F(xiàn)所示，通過與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖比對，它們分別為補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂乙素和補骨脂酚。

2.2 給EEFP后大鼠尿UPLC-Q-TOF-MS代謝指紋圖譜

圖2和圖3分別為EEFP給藥后大鼠尿樣正、負(fù)離子模式下的TIC。與空白對照組比較，EEFP組代謝指紋圖譜均表現(xiàn)出一定的差異，各給藥組之間也表現(xiàn)出一定的差異性，其中EEFP 1.08和1.62 g·kg-1組變化較為明顯，尤以保留時間11～15 min變化最為顯著。

Fig.1 Photo diode array（A）and total ion chromatograms（TlC）fingerprints（B）of the ethanol extract of Fructus Psoraleae（EEFP）in positive ion mode and mass spectra of psoralen（C），isopsoralen（D），isobavachalcone（E）and bakuchiol（F）.

Fig.2 Ultra-performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）TlC profiles of urine samples after rats were ig administered with EEFP for 2 weeks in positive ion mode.A：blank control group；B，C and D：EEFP 0.54，1.08 and 1.62 g·kg-1groups，respectively.

Fig.3 UPLC-Q-TOF-MS TlC profiles of urine samples after rats were ig given EEFP for 2 weeks in negative ion mode.A：blank control group；B，C and D：EEFP 0.54，1.08 and 1.62 g·kg-1groups，respectively.

2.3 方法學(xué)驗證

如圖4所示，正、負(fù)離子模式下的QC樣品聚成一團；另外分別選擇正、負(fù)離子模式4個離子，對它們的保留時間和峰面積進行分析，正、負(fù)離子模式下保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0%～0.18%和0%～0.65%，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.52%～3.57%和5.15%～6.16%。

Fig.4 Principal component analysis（PCA） score plots of quanlity control（QC）samples in ES+（A）and ES－（B）.○：QC samples；●：blank control group；△：EEFP 0.54 g·kg-1group；▲：EEFP 1.08 g·kg-1group；□：EEFP 1.62 g·kg-1group.

以上結(jié)果顯示，本實驗方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可用來進行大批量的代謝組學(xué)實驗。

2.4 EEFP對大鼠尿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物影響的組學(xué)分析

PCA分析法結(jié)果見圖5（A，B），各組樣本點較好地聚合在一起，EEFP 0.54，1.08和1.62 g·kg-1組樣本點均與空白對照組樣本點完全分離，各給藥組樣本點與空白對照組樣本點的距離隨給藥濃度的增加而增大，說明給藥后大鼠尿液中內(nèi)源性物質(zhì)的代謝發(fā)生明顯的變化，且呈劑量依賴性關(guān)系，同時空白對照組和各給藥組樣本分布較為分散，說明組內(nèi)差異較大。

PLS-DA分析結(jié)果如圖5（C，D）所示，各組樣本點按照組別差異聚攏，相互靠近，說明PLS-DA分析法能很好地消除組內(nèi)差異，保留組間差異。

選取EEFP高劑量組和空白對照組進行OPLSDA分析比較，確定主要差異性變量。兩組的OPLS-DA得分及變量重要程度（VIP）見圖6，每個點代表一個變量，S-Plot圖橫坐標(biāo)代表變量的貢獻度（協(xié)方差），縱坐標(biāo)代表變量的相關(guān)性（可信度），取值在－1～+1。S-Plot圖中離原點越遠(yuǎn)的點，表示其差異性越明顯；VIP值越高，表示該變量對模型的貢獻度越高。

Fig.5 PCA score plots（A，B）and PLS-DA score plots（C，D）about EEFP on endogenous metabolites after rats were ig given EEFP for 2 weeks in ES+（A，C）and ES－（B，D）.○：blank control group；●：EEFP（0.54 g·kg-1）group；△：EEFP 1.08 g·kg-1group；▲：EEFP 1.62 g·kg-1group.

Fig.6 S-plots（A，B）and VlP plots（C，D）associated with theOPLS-DA obtained for the data derived from the blank control group（A，C）and EEFP-treated group（1.62 g·kg-1）after rats were ig given EEFP for 2 weeks in ES+（A，C）and ES-（B，D）.

2.5 可能受EEFP影響的大鼠尿內(nèi)源性物質(zhì)

選取S-Plot圖中橫坐標(biāo)絕對值＞0.001，縱坐標(biāo)絕對值＞0.8的變量，通過比對質(zhì)荷比、保留時間及質(zhì)譜圖，共鑒定出5種物質(zhì)，其結(jié)果見表1，它們分別是D-泛酸-L-半胱氨酸、5-L-谷氨?；?牛磺酸、葡萄糖酸內(nèi)酯、半乳糖-β-1.4-木糖和對甲酚葡糖苷酸。

2.6 EEFP對大鼠尿中5種內(nèi)源性代謝性產(chǎn)物含量的影響

如表2所示，EEFP 0.54，1.08和1.62 g·kg-1組中對甲酚葡糖苷酸和半乳糖-β-1.4-木糖的相對含量明顯低于空白對照組（P＜0.01）；EEFP 1.08和1.62 g·kg-1組中5-L-谷氨?；??；撬帷⑵咸烟撬醿?nèi)酯相對含量明顯高于空白對照組（P＜0.01）；EEFP 1.62 g·kg-1組D-泛酸-L-半胱氨酸相對含量明顯高于空白對照組（P＜0.01）；另外，隨EEFP給藥劑量的增大，大鼠尿液中5-L-谷氨?；??；撬?、葡萄糖酸內(nèi)酯及D-泛酸-L-半胱氨酸含量呈升高趨勢（P＜0.01），而半乳糖-β-1.4-木糖和對甲酚葡糖苷酸的含量呈減少趨勢（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of EEFP on the contents of p-cresol glucuronide，5-L-glutamyl-taurine，galactose-beta-1.4-xylose，gluconolactone and D-pantothenoyl-L-cysteine in urine of rats

3 討論

本研究結(jié)果顯示，給藥后各組大鼠的代謝輪廓均發(fā)生了明顯的變化，初步篩選出5種生物標(biāo)志物，它們分別是D-泛酸-L-半胱氨酸、5-L-谷氨?；??；撬?、葡萄糖酸內(nèi)酯、半乳糖-β-1，4-木糖和對甲酚葡糖苷酸。

D-泛酸-L-半胱氨酸參與了輔酶A的合成［7］，而輔酶A是一種含有泛酸的輔酶，它能激活體內(nèi)的物質(zhì)代謝，加強物質(zhì)在體內(nèi)的氧化并供給能量［8］。與空白對照組比較，D-泛酸-L-半胱氨酸在各給藥組均呈明顯的升高趨勢，說明了EEFP能促進機體能量代謝。

5-L-谷氨酰基-?；撬崾桥；撬岷痛闻；撬岬闹虚g代謝產(chǎn)物，與空白對照組比較，其在各給藥組中呈升高的趨勢，說明EEFP能引起體內(nèi)牛磺酸含量升高。?；撬崾菑V泛分布于動物組織細(xì)胞內(nèi)的氨基酸，是機體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，?；撬嵩隗w內(nèi)的合成是通過半胱亞磺酸脫羧酶的作用，由半胱氨酸而來［9］。研究表明運動可使自由基增加，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，損傷組織細(xì)胞膜，補充?；撬崮茏枰诌@種改變，提高運動能力［10］。

葡萄糖酸內(nèi)酯是葡萄糖氧化生成的一種衍生物，其在各給藥組中呈升高的趨勢。研究表明，葡萄糖酸內(nèi)酯能清除氧自由基，保護皮膚免受紫外照射的傷害［11］。另外，半乳糖-β-1，4-木糖和對甲酚葡糖苷酸在各給藥組中呈下降趨勢，其中對甲酚葡糖苷酸是酪氨酸的代謝產(chǎn)物，酪氨酸在體內(nèi)代謝生成對甲酚，對甲酚主要以硫酸鹽和葡糖苷酸結(jié)合形式從腎排出體外。研究表明，對甲酚可作為一個評價腎功能的重要標(biāo)志物，其在體內(nèi)蓄積可致腎毒性［12］。半乳糖-β-1，4-木糖屬于二糖，是葡糖氨基聚糖類（glycosaminoglycans，GAG）的降解產(chǎn)物，而GAG是蛋白聚糖類的主要物質(zhì)，蛋白聚糖廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)，在細(xì)胞生長和分化方面起著重要的作用。

通過分析上述5種生物標(biāo)志物，D-泛酸-L-半胱氨酸和5-L-谷氨?；??；撬崤c能量代謝有關(guān)，這兩種物質(zhì)在給藥后呈升高趨勢，說明EEFP可促進機體能量代謝，這與鄒潤等［13］研究發(fā)現(xiàn)EEFP具有緩解疲勞的作用具有一致性。葡萄糖酸內(nèi)酯升高提示糖代謝過程增強，由于其能夠清除氧自由基，保護皮膚免受紫外照射的傷害，這可能也是其用于治療皮膚病的原因所在。對甲酚葡糖苷酸和半乳糖-β-1，4-木糖給藥后呈下降趨勢，其中對甲酚葡糖苷酸是對甲酚的腎排泄形式，對甲酚葡糖苷酸在尿中含量減少，提示其腎排泄可能遭受障礙；半乳糖-β-1，4-木糖是葡糖氨基聚糖類的降解產(chǎn)物，其在尿中減少，說明機體內(nèi)細(xì)胞的生長和分化受到抑制，而肝是細(xì)胞生長和分化最活躍的部位，提示其可能與肝毒性有關(guān)。

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS的代謝組學(xué)方法從整體尿液代謝表型及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的角度初步探索了EEFP藥效和毒效機制，所建立的方法可以為傳統(tǒng)中藥的藥效和毒性評價提供一定的參考。

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Corresponding authors：HUANG Xian-ju，Tel：13986035659，E-mail：huangxianju1972@yahoo.cn；GAO Yue，Tel：（010）66931312，E-mail：gaoyue@bmi.ac.cn

（本文編輯：喬 虹）

Effect of ethanol extract of Fructus Psoraleae on urinary endogenous metabolites of rats

HU Chao1，TANG Xiang-lin2，LI Jie2，LIANG Qian-de2，WANG Yu-guang2，MA Zeng-chun2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，ZHAO Yong-hong2，HUANG Xian-ju1，GAO Yue2
（1.Department of Physiology and Pharmacology，College of Pharmacy，South Central University for Nationalities，Wuhan 430000，China；2.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To study the effect of the ethanol extract of Fructus Psoraleae（EEFP）on endogenous metabolites in rat urine based on metabolomics.METHODS Male SD rats were orally administered with EEFP at the doses of 0.54，1.08 and 1.62 g·kg-1，respectively，once a day for two consecutive weeks.Urine samples were collected for 12 h after the last administration.Data were acquired with the MassLynx software based on ultra-performance liquid chromatography quadrupoletime-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）.The principal component analysis（PCA）and partial least squares-discriminant analysis（PLS-DA）were used to analyze the difference of endogenous metabolites in different groups，then putative biomarkers were found through the orthogonal partial least-squares-discriminant analysis（OPLS-DA），variable importance in the projection（VIP）and t test and their relative intensity were determined.RESULTS The results of PCA showed that samples of each group were clustered，all the groups were separated，and that the distance between the EEFP groups and the blank control group was increased in a dose-dependent manner.The relative contents of p-cresol glucuronide and galactose-beta-1，4-xylose were 40.0±11.2，2.7±2.6，16.8±6.3 and 45.9± 16.4，32.6±22.1，8.0±8.3 in the EEFP 0.54，1.08 and 1.62 g·kg-1groups，respectively，significantly lower than those of the control group，which were 107.0±26.9 and 82.3±13.6（P＜0.01），respectively.The relative contents of 5-L-glutamyl-taurine，and gluconolactone were 22.4±10.0，47.6±19.1 and 138.2± 18.8，337.3±64.0 in EEFP 1.08 and 1.62 g·kg-1groups，respectively，significantly higher than those of the blank control group，which were 2.6±1.6 and 20.5±6.8，respectively（P＜0.01）.The relative content of D-pantothenoyl-L-cysteine was 74.2±31.5 in the EEFP 1.62 g·kg-1group，significantly higher than that in the blank control group（0.6±0.5）（P＜0.01）.As the dose of EEFP increased，D-pantothenoyl-L-cysteine，5-L-glutamyl-taurine，and gluconolactone had an upward trend（P＜0.01），while galactosebeta-1，4-xylose and p-cresol glucuronide had a downward trend（P＜0.01）.CONCLUSlON The twoweek administration of EEFP has effect on the endogenous metabolites in urine.The substances identified are mainly related to energy metabolism，taurine，tyrosine and glucose metabolism.

ethanol extract of Fructus Psoraleae；metabolomics；biomarkers；urine

The project supported by National Science and Technology Major Project（2014ZX09304307001-003）

R969.1，R285.5

A

1000-3002（2015）06-0931-08

國家科技重大專項（2014ZX09304307001-003）

胡 超，男，碩士，主要從事中藥毒理研究，Tel：（010）66930267，E-mail：1054013690@qq.com

黃先菊，E-mail：huangxianju1972@yahoo.cn，Phn：13986035659；高月，E-mail：gaoyue@bmi.ac.cn，Tel：（010）66931312

（2015-04-03接受日期：2015-07-02）