蛋白酶體抑制劑萬珂對腦缺血再灌注損傷保護作用機制的研究

薛晶等

[摘要] 目的 探討萬珂對腦缺血再灌注后細胞凋亡及線粒體的發(fā)生變化程度，探討對腦缺血起到的保護作用。 方法 將實驗于2012年5月—2013年12月期間選用的大鼠15只隨機分為萬珂治療組5只、假手術組5只、生理鹽水組5只。模型組馬上進行萬珂0.2 mg/kg尾靜脈注射，對照組注射相同量的生理鹽水，在24 h的時間點進行取材。免疫組化法測Cyt C、Caspase-3；神經(jīng)細胞凋亡選擇TUNEL法進行檢測。結(jié)果 假手術組凋亡細胞亦少見，偶見Cyt C、Caspase-3免疫反應陽性細胞，萬珂組Cyt C、Caspase-3免疫反應陽性細胞及凋亡細胞明顯減少，生理鹽水組見大量上述細胞，且兩組上述各項數(shù)據(jù)對比，差異有統(tǒng)計學意義，兩組與假手術組上述各項數(shù)據(jù)對比，差異亦均有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 萬珂是蛋白酶體抑制劑具有保護線粒體功能，明顯的抑制炎癥反應高峰形成，縮小腦梗死體積，減輕細胞凋亡，保護神經(jīng)的作用。

[關鍵詞] 萬珂；腦缺血再灌注；凋亡；細胞色素C

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）06（c）-0095-02

[Abstract] Objective To observe the effects of VELCADE on cell apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion and the level of mitochondrial changes and study on its protective effects to cerebral ischemia. Methods 15 laboratory rats from 2012 May to 2013 December were randomly divided into VELCADE groups and pseudo surgery group and saline group with 5 in each group. VELCADE groups received caudal vein injection of 0.2 mg/kg VELCADE and the control groups received saline injection of the same volume and experimental materials were collected after 24 h. Cyt C、Caspase-3 was detected by immunohistochemical and the neuronal apoptosis was detected by TUNEL. Results Fake surgery group apoptosis died cell also rare， occasionally Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell， VELCADE group Cyt c， and Caspase-3 immune reaction positive cell and the apoptosis died cell obviously reduced， saline group see large above cell， and two group above the data compared， differences significantly has statistics meaning， two group and fake surgery group above the data compared， differences also are has statistics meaning. Conclusion VELCADE is a proteasome inhibitor， and it has a protective function of mitochondria and can significantly inhibits the inflammatory response to peak form， reduces the volume of cerebral infarction and apoptosis， protects neural function.

[Key words] VELCADE； Cerebral ischemia-reperfusion； Apoptosis ； Cytochrome C

蛋白酶體抑制劑為新型的抗腫瘤藥物，2003年已被FDA批準用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤，它可通過誘導異常分裂的腫瘤細胞凋亡起到抗腫瘤的作用，目前國外有研究結(jié)果顯示，蛋白酶體抑制劑還可通過抑制炎癥反應因子NF-κBp65、IL-1β的表達有顯著的減輕炎癥反應的作用[1]，而腦缺血再灌注后腦局部的炎癥反應是造成再灌注損傷的重要原因之一，故國外學者將其應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，并證實其通過抑制炎癥反應，對腦缺血大鼠有減輕神經(jīng)細胞凋亡的作用，但國內(nèi)尚無此方面的研究。該實驗將其用于腦缺血再灌注大鼠，已證實其可抑制細胞凋亡，減小腦梗塞體積，有很好的腦保護作用，但具體機制不祥，已知細胞凋亡途徑有三種，該類藥物是通過何種途徑抑制凋亡尚不清楚，該實驗在2012年5月—2013年12月期間選用15只大鼠為研究對象，欲采用萬珂對腦缺血再灌注大鼠進行治療，觀察影響線粒體途徑的指標，目的是進一步探討該類藥物的腦保護作用機制，為該類藥物擴大臨床適應癥奠定理論基礎，同時也為臨床治療開辟新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該實驗在2012年5月—2013年12月期間選用15只普通級健康雄性Wistar大鼠， 鼠齡（3～4）個月，體重260～280 g，隨機分為假手術組、生理鹽水對照組、萬珂治療組每組5只。大鼠大腦中動脈缺血模型采用線栓法制作，腦缺血2 h再灌注即刻給予萬珂0.2 mg/kg尾靜脈注射，對照組以相同的生理鹽水，在腦缺血2 h再灌注24 h取材，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射對大鼠進行麻醉，經(jīng)心臟灌注固定、取材，將視交叉后腦組織2 mm層面多聚甲醛緩沖液固定24 h，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、連續(xù)切取同一層面5張切片，切片厚5 μm，用于檢測Cyt C、Caspase-3及細胞凋亡。

1.2 檢測方法

免疫組化法檢測Cyt C、Caspase-3，TUNEL法檢測神經(jīng)細胞凋亡，采用顯微鏡進行觀察，每只大鼠取5張切片選相同部位計數(shù)陽性細胞數(shù)（400倍），選擇數(shù)碼相機進行拍照。

1.3 統(tǒng)計方法

全部資料選擇SAS 9.0版統(tǒng)計軟件進行分析，所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗。

2 結(jié)果

免疫組化法測Cyt C、Caspase-3與細胞凋亡：假手術組凋亡細胞亦少見，偶見Cyt C、Caspase-3免疫反應陽性細胞，萬珂組Cyt C、Caspase-3免疫反應陽性細胞及凋亡細胞明顯減少，生理鹽水組見大量上述細胞，且兩組上述各項數(shù)據(jù)對比，差異有統(tǒng)計學意義，兩組與假手術組上述各項數(shù)據(jù)對比，差異均有統(tǒng)計學意義。見表1。

3 討論

該研究充分證實腦缺血再灌注后及時應用蛋白酶體抑制劑萬珂0.2 mg/kg具有明顯的抑制炎癥反應高峰形成，很大程度縮小了腦梗死體積，有助于減輕細胞凋亡，保護神經(jīng)的作用[2]。研究顯示在腦缺血時，ATP耗竭可影響蛋白質(zhì)泛素化的級聯(lián)反應，并且能夠抑制蛋白酶體活性，致使蛋白酶體清除氧化應激蛋白的能力水平顯著下降，與此同時氧化應激損害進一步促進對蛋白酶體活性的抑制[3]，這樣的惡性循環(huán)，造成蛋白聚集及神經(jīng)元死亡。除此之外依據(jù)相關研究顯示短暫性腦缺血時大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元會出現(xiàn)泛素化蛋白聚集過程，線粒體膜上還會呈現(xiàn)出蛋白聚集[4]，因此萬珂有助于蛋白聚集的程度，可以引領細胞凋亡過程發(fā)生。

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器之一，在細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞氧化還原狀態(tài)以及滲透壓調(diào)節(jié)中起非常突出的作用[5]。線粒體即可出現(xiàn)功能與結(jié)構的改變，這說明線粒體在早期的細胞凋亡過程中具有啟動功能[6]，而細胞凋亡的早期事件是細胞色素C從線粒體釋放的過程，CytC在細胞凋亡產(chǎn)生的信號傳導過程中起作用是至關重要的。細胞凋亡的過程中信號轉(zhuǎn)導通路的線粒體凋亡通路在細胞生存和死亡中發(fā)生了非常重要作用，目前認為凋亡過程的早期信號轉(zhuǎn)導主要通過線粒體途徑來完成的[7]。此項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應用蛋白酶體抑制劑治療過程中，Cyt C的釋放明顯減少，萬珂組（34.21±1.82），生理鹽水組（46.13±1.55），P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，線粒體凋亡通路中Caspase-3蛋白的表達亦相應減少，萬珂組（32.04±1.31），生理鹽水組（52.49±1.20），P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，同時凋亡的細胞也明顯減少，萬珂組（33.14±2.56），生理鹽水組（52.25±4.12），P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。經(jīng)過查證相關資料顯示[7]，此項研究結(jié)果與國外其他報道的研究水平相一致。該研究已證實蛋白酶體抑制劑可通過抑制線粒體凋亡途徑有腦保護作用，此項研究結(jié)果在國內(nèi)外尚未見相關報道。目前深入研究其與腦缺血之間的關系，可能為臨床上減輕腦缺血損傷提供新的治療方案，使萬珂有望成為很有前景的藥物靶標。下一步將進一步研究線粒體結(jié)構方面的變化，同時研究其對血腦屏障的通透情況，為其臨床應用奠定理論基礎。

總之，此項研究還發(fā)現(xiàn)應用蛋白酶體抑制劑治療過程中，Cyt C的釋放明顯減少，線粒體凋亡通路中Caspase-3蛋白的表達亦相應減少，同時凋亡的細胞也明顯減少，其作用機制可能主要通過減少Cyt C的釋放、減輕炎癥反應過程，阻斷了線粒體凋亡途徑，抑制腦細胞凋亡，從而發(fā)揮大腦保護作用。

[參考文獻]

[1] Fang-Ting， Chen Chung-May，Yang Chang-Hao， et al.The protective effects of the proteasome inhibitor bortezomib （velcade） on ischemia-reperfusion injury in the rat retina[J].Plos one，2013，8（5）： e64262.

[2] 薛晶.萬珂對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制[J].中國實用醫(yī)藥，2014，9（25）：256.

[3] Jie， Cui Zhi，Li Ling-bo，Qian Qin，et al.Reducing the oxidative stress mediates the cardioprotection of bicyclol against ischemia-reperfusion injury in rats[J].Journal of Zhejiang University，2013，14（6）：487.

[4] LiJ， Liu N， Wang Y，et al. Inhibition of EphA4 signaling after ischemia-reperfusion reduces apoptosis of CA1 pyramidal neurous[J].Neurosci Lett，2012，518（2）：92.

[5] Huang XP， Tan H， Chen BY， et al.Astragalus extract allebiates nerve injury after cerebral ischemia by improving energy metabolism and inhibiting apoptosis[J].Biol Pharm Bull，2012，35（4）：449.

[6] Maik，Hüttemann Stefan，Helling ThomasH，et al.Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling： cytochrome c oxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation[J].Biochimica et biophysica acta，2012，1817（4）： 598.

[7] 張寧.線粒體分裂抑制劑在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用及其機制[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2013，12（4）：354.

（收稿日期：2015-03-21）