血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力的影響*

張澤曦，李墨靈，杜天樂，夏慶梅，張　晗

·學生園地·

血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力的影響*

張澤曦，李墨靈，杜天樂，夏慶梅，張晗

（天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

［目的］考察不同血清含量以及培養(yǎng)不同時間對人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT）細胞的生長及遷移特性的影響，為HaCaT細胞劃痕實驗條件優(yōu)化提供實驗數(shù)據(jù)支撐。［方法］培養(yǎng)HaCaT細胞，按10%血清濃度全培基（全培基陽性對照組）、2%低濃度血清培基（低血清培基組）及無血清培基（對照組）分組，通過進行細胞劃痕實驗，CCK-8細胞活力檢測、Brdu細胞增殖實驗，分析HaCaT生長特性。［結果］在24 h內(nèi)，低血清培基組HaCaT細胞與全培基組相比，細胞增殖能力無明顯差異，細胞活力有增高的趨勢。細胞孵育48 h后，全培基組細胞增殖能力及活力明顯升高。24～48 h，全培基組細胞增殖能力及細胞活力的提升速度明顯高于低血清培基組。［結論］培養(yǎng)基中血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力具有重要影響，培養(yǎng)24 h內(nèi)低血清培養(yǎng)條件有利于劃痕實驗的觀察與測定。

HaCaT細胞；劃痕實驗；創(chuàng)傷修復；方案優(yōu)化

角質(zhì)形成細胞是人表皮的兩大類主要組成細胞之一。人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）是由成人表皮細胞自發(fā)轉(zhuǎn)化而來的細胞系，具有永生性，并與角質(zhì)形成細胞具有相似的增殖、分化特性，遺傳特性穩(wěn)定［1］，是現(xiàn)代生物醫(yī)學實驗中常使用的一種細胞系。國內(nèi)外學者常將該細胞系應用于治療各類皮膚病的藥物實驗研究中，包括皮膚修復愈合、銀屑病、防曬等研究［2-3］。創(chuàng)傷修復是一個涉及表皮角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞等多種類型細胞間相互作用以及多個病理生理反應機制的復雜過程［4-5］。因此，很多人也將HaCaT細胞應用于有關皮膚燒傷后創(chuàng)傷修復的研究：研究促進創(chuàng)面修復的因素［6］，HaCaT細胞過度增殖而引起的創(chuàng)傷后創(chuàng)面過再生的問題［7］，以及利用HaCaT細胞為種子細胞構建新型人組織工程皮膚［8］。

細胞劃痕實驗是一種操作簡單的研究細胞遷移的體外實驗方法，在一定程度上模擬了體內(nèi)細胞遷移的過程，是研究創(chuàng)傷愈合的常用檢測方法之一［9-10］。創(chuàng)傷愈合是細胞遷移和增殖共同作用的結果，在實際細胞劃痕實驗中，研究者為觀察藥物對細胞遷移的作用，常采用低血清培養(yǎng)條件，以降低細胞增殖能力，減少血清對藥物作用的干擾。應用人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT進行劃痕實驗研究發(fā)現(xiàn)，在2%低血清培基孵育細胞24 h后與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢更為明顯，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，全培基組劃痕愈合率明顯高于低血清培基組。在此基礎上，通過培養(yǎng)HaCaT細胞，進行CCK-8細胞活力檢測、Brdu增殖實驗，考察不同血清含量以及培養(yǎng)不同時間對HaCaT細胞的生長及遷移特性影響，為HaCaT細胞劃痕實驗條件優(yōu)化提供實驗數(shù)據(jù)支撐，現(xiàn)將對此研究報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞人永生化角質(zhì)形成細胞（HaCaT），購自北京協(xié)和細胞庫。

1.1.3細胞培養(yǎng)試劑與檢測試劑 MEM/eb（sHyClone）、胎牛血清（BI）、雙抗（HyClone青霉素+鏈霉素，青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 000 μg/mL）、胰酶（0.25%胰蛋白酶+0.125%EDTA、BI）、BrdU試劑（羅氏）、CCK-8檢測試劑盒（Dojindo）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與分組HaCaT細胞以2×105cells/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在溫度37℃和5%二氧化碳的環(huán)境下，用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM/ebs培基培養(yǎng)。當細胞貼滿瓶底90%～100%時，使用胰酶傳代。將HaCaT細胞分別接種于10%血清濃度全培基（全培基陽性對照組，10%FBS組）、2%低濃度血清培基（低血清培基組，2%FBS組）及無血清培基（對照組，0%FBS組）的24或96孔板中培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.2細胞劃痕實驗按每孔3×104細胞濃度接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁90%以上，更換無血清培基，16 h后，將細胞如上分組，使用細胞劃痕器進行細胞劃痕，并繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48 h鏡下觀察照相比較，計算劃痕損傷面積愈合率。

1.2.3CCK-8法活力檢測按每孔3×104細胞濃度接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁70%，更換無血清培基，16 h后按如上分組，培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入100 μL的10%CCK-8試劑，溫箱孵育30 min后用酶標儀檢測A值。

1.2.4Brdu增殖實驗以每孔3×104細胞接種HaCaT細胞于96孔板，待板中的細胞貼壁70%，待板中的細胞貼壁70%以上，更換無血清培基同步化培養(yǎng)16 h，按如上分組，24 h和48 h后，依照BrdU試劑盒說明書操作檢測，在450 nm處測量A值。

2　實驗結果

2.1細胞劃痕實驗細胞劃痕培養(yǎng)24 h后，無血清培基組面積愈合率為（17.07±6.15）%，低血清培基組面積愈合率為（40.19±4.7）%，全培基組面積愈合率為（37.94±4.2）%。無血清培基組與全培基組、低血清培基組相比存在明顯差異（P＜0.01）。細胞劃痕培養(yǎng)48h后，無血清培基組面積愈合率為（19.95±6.6）%，低血清培基組面積愈合率為（44.68±5.17）%，全培基組（62.37±3.69）%，無血清培基組與低血清培基組、全培基組相比存在顯著差異（P＜0.01）。低血清培基組與全培基組相比，存在明顯差異（P＜0.01）。見圖1。

2.2CCK-8細胞活力檢測細胞孵育24 h后，無血清培基組A值為（0.58±0.03），低血清培基組A值為（0.68±0.05），全培基組A值為（0.62±0.03）。24 h檢測，低血清培基、全培基組與無血清培基組相比存在差異（P＜0.05），低血清培基組與全培基組相比存在差異（P＜0.05）。細胞孵育48 h后，無血清培基組A值為（0.63±0.08），低血清培基組A值為（0.73± 0.03），全培基組A值為（0.88±0.05）。低血清培基組、全培基組與無血清培基組相比，均存在顯著差異（P＜0.01）。低血清培基組與全培基組相比存在顯著差異（P＜0.01）。與24 h相比，48 h的無血清培基組細胞平均活力增長了9%，低血清培基組細胞平均活力增長了7%，全培基組細胞平均活力增長了42%。24～48 h，全培基組細胞活力明顯高于低血清培基組和無血清培基組。見表1、圖2。

圖1　不同培基對HaCaT細胞劃痕的影響

表1　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

表1　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

注：與24 h的0%FBS相比，*P＜0.05；與24 h的10%FBS組相比，#P＜0.05；與48 h的0%FBS組相比，△P＜0.01；與48 h的10%FBS組相比，▲P＜0.01。

組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時間（h）　CCK-8 A值24　0.58±0.030 48　0.63±0.080* 24　0.68±0.050*#48　0.73±0.030△▲24　0.62±0.038 48　0.88±0.050△

圖2　不同培基對HaCaT細胞活力的影響

2.3Brdu實驗細胞孵育24 h后無血清培基組吸光度為（1.13±0.28），低血清培基組吸光度為（1.58± 0.14），全培基組吸光度（1.48±0.06），與無血清培基組相比、低血清培基組、全培基組間均存在明顯差異（P＜0.01）。細胞孵育48 h后無血清培基組吸光度為（1.20±0.14），低血清培基組吸光度為（1.73±0.12），全培基組吸光度為（1.87±0.11）。與24 h相比，48 h的無血清培基組細胞增殖率平均值提高了6%，低血清培基組細胞增殖率平均值提高9%，全培基組細胞增值率平均值提高了26%。24～48 h，全培基組細胞增殖能力提高速度明顯高于低血清培基組和無血清培基組。見表2、圖3。

表2　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

表2　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

注：與孵育24 h的0%FBS相比，*P＜0.01；與孵育48 h的0% FBS組相比，#P＜0.01。

組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時間（h）　CCK-8 A值24　1.13±0.28 48　1.20±0.14 24　1.58±0.14* 48　1.73±0.12#24　1.48±0.068 48　1.87±0.11#

圖3　不同培基對HaCaT細胞增殖能力的影響

3　結論與討論

在本研究中，采用HaCaT細胞進行細胞劃痕、CCK-8細胞活力檢測、Brdu增殖實驗，結果顯示：在24 h內(nèi)，低血清培基組HaCaT細胞與全培基組相比，細胞增殖能力無明顯差異，細胞活力有增高的趨勢。隨著孵育時間的延長，細胞孵育48 h后，全培基組細胞增殖能力及細胞活力明顯升高，其增殖速率明顯高于低血清培基組。

細胞劃痕實驗常用于檢測藥物對皮膚角質(zhì)、成纖維細胞，血管內(nèi)皮、平滑肌細胞，神經(jīng)元以及腫瘤細胞的遷移或侵襲能力［11-12］，是考察細胞運動能力的常用實驗之一［13-14］。在劃痕實驗操作方法中，常推薦研究者采用無血清或低血清培養(yǎng)條件，減少血清對細胞增殖的影響［15-16］。但實驗中，若只研究藥物對細胞遷移能力的影響，同時考慮到藥物孵育時間（24～72 h），研究者常采用低血清培養(yǎng)條件，以期降低細胞增殖能力，減少變量干擾的同時保證細胞正常的存活狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，劃痕24 h后，低血清培基孵育細胞與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢更為明顯，同時CCK-8和Brdu實驗結果也證實低血清培基組與全培基組相比在24 h并不能抑制細胞增殖能力，且細胞活力較全培基組有升高的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象考慮可能有兩種原因：1）低血清濃度的培基可能使該細胞產(chǎn)生代償性增殖［17］。2）在24 h內(nèi)，低血清培基中的營養(yǎng)與生長因子可能負擔其增殖所需，而隨著細胞增殖到一定數(shù)量，低血清培基的營養(yǎng)與生長因子已經(jīng)不足以負擔該細胞繼續(xù)增殖。因此隨著培養(yǎng)時間的延長，低血清培基組細胞的增殖速率逐漸下降。在培養(yǎng)48 h后，全培基組顯示其劃痕愈合率明顯高于低血清培基組，全培基組細胞增殖能力與活力明顯升高，其增殖速率明顯高于低血清培基組。根據(jù)考察藥物作用的不同以及藥物孵育時間的長短，應重視無血清或低血清培養(yǎng)條件的選擇。絲裂霉素（MMC）具有抑制成纖維等細胞分裂增殖的能力［18］，是劃痕實驗中經(jīng)常使用的細胞增殖抑制劑之一［19-20］。在實驗中，若只考察藥物短時間內(nèi)（24 h以內(nèi)）對細胞遷移能力的影響，采用無血清培養(yǎng)條件可能較為適宜，或者考慮加入適量絲裂霉素。

上述研究提示，雖然劃痕實驗是一種操作簡單，普遍使用的經(jīng)典實驗方法，但在實際的操作過程中仍應根據(jù)實驗目的、細胞狀態(tài)、藥物選擇與孵育時間等因素選擇適宜的實驗條件，調(diào)整實驗方法，從而得到更穩(wěn)定準確科學的實驗結果。培養(yǎng)基中血清含量對HaCaT細胞生長特性及遷移能力具有重要影響，選擇適宜血清培養(yǎng)條件有利于劃痕實驗觀察與測定。

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Effect of serum content on the growth characteristic in the HaCaT cells

ZHANG Ze-xi，LI Mo-ling，DU Tian-le，XIA Qing-mei，ZHANG Han
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］By studying the growth characteristic of the HaCaT cells in conditions of the serum free medium，low serum medium and the serum medium.Put forward the optimization scheme of the HaCaT Wound scratch assay.［Methods］Culture HaCaT cell，grouped into 10%serum medium（positive control group），2%low serum prudential（low serum prudential group）and serum free prudential（control group），through the HaCaT wound scratch assay，CCK-8 assay，Brdu assay，analysis the HaCaT growth characteristics.［Results］With in 24 h，low serum prudential group HaCaT cells compared with the positive control group，no difference between the cell proliferation，cell vitality had increase tendency，incubation cells after 48 h，positive control group cell proliferation ability and cell viability higher than low serum prudential group.Between 24 h and 48 h，10%serum medium positive control group cell proliferation ability and speed of cell viability was obviously higher than that of low serum prudential group.［Conclusion］If it is only in the actual experiments，study drug in a short period of time（within 24 h）on HaCaT cell migration ability，the influence of culture in serum-free conditions may be more appropriate.

HaCaT cell；wound scratch assay；wound healing；optimization experiment

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0369-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.14

大學生科技創(chuàng)新基金（CXJJ2012C02）；國家自然基金（81373789）。

張澤曦（1993-），男，天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院2011級學生。

張晗，E-mail：zhanghan0023@126.com。

（2015-08-15）