rhGH對老年多器官功能不全患者CD47、L-選擇素及高級氧化蛋白產(chǎn)物表達(dá)的影響

劉軍，甄平，李旭升，李慎松，田琦，楊潔，何曉樂

老年多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome in the elderly，MODSE)是指老年人在器官老化和患有多種慢性疾病的基礎(chǔ)上，由某種誘因激發(fā)，在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)2個或2個以上器官序貫或同時(shí)發(fā)生功能不全或衰竭的臨床綜合征[1]。盡管當(dāng)今全球醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，但對MODSE高?；颊叩姆乐稳韵鄬Ψα?。最新研究表明，膜糖蛋白CD47和L-選擇素(L-selectin)與MODSE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]，高級氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)作為反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的新指標(biāo)和新型炎性介質(zhì)，也逐漸受到臨床和基礎(chǔ)研究的重視[4]。重組人生長激素(recombination human growth hormone，rhGH)可提高T淋巴細(xì)胞的增殖和巨噬細(xì)胞的吞噬能力[5]，并有學(xué)者認(rèn)為其能增強(qiáng)患者的體液免疫及細(xì)胞免疫功能[6]。本研究觀察MODSE患者應(yīng)用rhGH后膜糖蛋白CD47﹑L-選擇素和血清AOPPs濃度的改變，探討rhGH的臨床療效及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2013年10月－2014年10月在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院住院并符合美國胸科醫(yī)師學(xué)會和危重病醫(yī)學(xué)會聯(lián)席會議(ACCP/CCM)聯(lián)合倡議提出的MODSE診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]的患者共66例，其中男40例，女26例，年齡65～101歲，平均82歲。排除艾滋病﹑腫瘤﹑結(jié)締組織疾病和精神疾病患者。所有患者于采血前2周無靜脈注射或口服維生素C﹑維生素E或其他有明確抗氧化作用藥物史。對MODSE患者在治療前及治療后的第3﹑14﹑28天進(jìn)行急性生理學(xué)與慢性健康狀況(APACHE)Ⅲ評分，且于治療后的第3﹑14﹑28天統(tǒng)計(jì)MODSE患者生存或病死率。

1.2 研究方法及觀察指標(biāo) 隨機(jī)將患者分為治療組(n=33)及對照組(n=33)。對照組患者給予常規(guī)治療，治療組患者從入院當(dāng)天開始即在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予皮下注射rhGH，0.4U/(kg.d)，1/d，連續(xù)28d。兩組患者分別于治療前及治療后的第3﹑14﹑28天清晨在空腹﹑安靜狀態(tài)下采集外周靜脈血8ml，置于無菌EDTA抗凝管。取其中5ml，用10%氯化銨裂解紅細(xì)胞，單克隆抗體染色后，采用流式細(xì)胞儀檢測CD47表達(dá)：分別加入對照管及rhGH治療管中各5μl，加入PBS緩沖液30μl，rhGH治療管加抗CD47-FITC 20μl，4℃避光孵育20min，PBS緩沖液洗3次，1%多聚甲醛固定，在流式細(xì)胞儀上檢測紅細(xì)胞表面CD47陽性率。L-選擇素﹑AOPPs試劑盒購自上海藍(lán)基生物工程公司。血漿L-選擇素水平按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定。采用分光光度法檢測血清AOPPs濃度：以20mmol/L PBS(pH7.4)按l:5比例稀釋血清(新鮮的血液樣本1ml抗凝后經(jīng)3000r/min低溫離心10min所獲)，吸取20μl稀釋血清(剩余的血清置于–70℃冰箱貯存)，加入20μl醋酸，搖勻后即刻于340nm下測定吸光度(A)值，血清AOPPs濃度從氯胺-T(0～200μmol/L)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得，并用PBS空白校正。實(shí)驗(yàn)所用儀器主要包括721分光光度計(jì)(上海第三儀器廠)﹑TOSHIBA RF40生化分析儀(日本東芝公司)﹑Facscalibur流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)。兩組均以28d為1個療程，每療程前后均檢查血常規(guī)﹑肝腎功能，觀察療效及不良反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測量方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組病死率比較 治療后第3﹑14及28天，治療組病死率(分別為9.10%﹑15.15%﹑18.18%)與對照組(分別為12.12%﹑21.21%﹑30.30%)比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 兩組患者APACHE Ⅲ評分比較 與治療前相比，對照組和治療組患者治療后的APACHE Ⅲ評分均明顯降低(P＜0.05)。對照組和治療組患者治療3﹑14﹑28d后，其APACHE Ⅲ評分均呈下降趨勢，尤以治療組(53.2±2.55﹑45.35±1.80﹑40.60±1.50)下降明顯(P＜0.05)，提示患者病情嚴(yán)重程度均明顯改善。治療組第14天的APACHE Ⅲ評分較治療第3天時(shí)明顯下降，且第28天時(shí)APACHE Ⅲ評分較治療第14天時(shí)明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

2.3 兩組患者CD47﹑L-選擇素及AOPPs的比較與治療前相比，對照組和治療組患者治療后CD47陽性率升高，L-選擇素水平下降，AOPPs濃度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療后第3﹑14﹑28天，治療組CD47陽性率與對照組比較均明顯升高(P＜0.05)，且治療后第14天治療組CD47陽性率明顯高于第3天，第28天CD47陽性率明顯高于第14天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療第3﹑14﹑28天，治療組L-選擇素水平﹑AOPPs濃度與對照組比較均明顯降低(P＜0.05)，且治療后第14天治療組的L-選擇素水平﹑AOPPs濃度明顯低于第3天(P＜0.05)，第28天L-選擇素水平﹑AOPPs濃度明顯低于第14天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 兩組患者APACHE Ⅲ評分比較(±s)Tab.1 Comparison of APACHE Ⅲ scores between the two groups (±s)

表1 兩組患者APACHE Ⅲ評分比較(±s)Tab.1 Comparison of APACHE Ⅲ scores between the two groups (±s)

The number of cases in control group before treatment and 3, 14, 28 days after treatment was 33, 29, 26 and 23, and that in treatment group was 33, 30, 28 and 27, respectively. (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with before treatment; (3)P＜0.05 compared with 3 days after treatment; (4)P＜0.05 compared with 14 days after treatment

Group Before treatment After treatment 3d 14d 28d Control group 60.00±3.00 55.20±2.50(2) 51.00±2.00(2) 47.50±2.00(2)Treatment group 60.50±3.00 53.20±2.55(1)(2) 45.35±1.80(1)(2)(3) 40.60±1.50(1)(2)(3)(4)

表2 兩組患者CD47陽性率﹑L-選擇素水平和AOPPs濃度變化比較(±s)Tab.2 Changes of CD47 expression, serum L-selectin level and AOPPs concentration in the two groups (±s)

表2 兩組患者CD47陽性率﹑L-選擇素水平和AOPPs濃度變化比較(±s)Tab.2 Changes of CD47 expression, serum L-selectin level and AOPPs concentration in the two groups (±s)

The number of cases in control group before treatment and 3, 14,28 days after treatment was 33, 29, 26 and 23, and that in treatment group was 33, 30, 28 and 27, respectively. (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with before treatment; (3)P＜0.05 compared with 3 days after treatment; (4)P＜0.05 compared with 14 days after treatment

Item Control group Treatment group CD47 positive rate (%)Before treatment 10.00±1.56 10.85±1.50 3d 13.32±1.40(2) 15.02±1.55(1)(2)14d 17.40±1.70(2) 25.15±1.98(1)(2)(3)28d 22.50±2.10(2) 36.72±2.23(1)(2)(3)(4)L-selectin (ng/ml)Before treatment 114.10±25.00 113.50±24.85 3d 112.85±21.15(2) 92.00±19.55(1)(2)14d 96.78±15.00(2) 70.11±21.30(1)(2)(3)28d 72.85±9.21(2) 52.07±18.33(1)(2)(3)(4)AOPPs (mmol/L)Before treatment 106.60±21.55 105.93±21.00 3d 105.12±19.32(2) 90.81±18.03(1)(2)14d 94.11±17.26(2) 65.90±16.35(1)(2)(3)28d 80.37±15.55(2) 45.19±15.92(1)(2)(3)(4)

3 討 論

目前已明確，外科MODSE的發(fā)生與應(yīng)激反應(yīng)或系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)相關(guān)，內(nèi)科疾病誘發(fā)的MODSE雖表現(xiàn)多樣，如老年心功能不全患者罹患MODSE的第一原因是感染，但究其本質(zhì)，與年齡因素﹑多種慢性病﹑營養(yǎng)不良等所致的免疫力低下明顯相關(guān)的各種感染性疾病是MODSE發(fā)展的關(guān)鍵誘因。免疫力降低導(dǎo)致的感染是這些系統(tǒng)衰竭的共同通道，延緩了機(jī)體免疫力的改善，影響康復(fù)。盡管抗生素的大量聯(lián)合應(yīng)用似乎可以控制感染，但卻治標(biāo)不治本，提高患者免疫力才是根本舉措。

rhGH是近年來利用DNA技術(shù)合成的生長激素，它的作用及生物動力學(xué)與垂體分泌的內(nèi)源性生長激素相同。其已明確的功能包括通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞和多形核中性粒細(xì)胞釋放超氧化物陰離子的方式來殺滅病原微生物，通過作用于肝細(xì)胞膜上的生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)，合成胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)，上調(diào)GH-IGF-Ⅰ軸活性，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬等細(xì)胞免疫功能等[8]。

CD47是一種普遍存在于人類細(xì)胞表面的膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族，原被稱為整合素相關(guān)蛋白。CD47在人體未成熟和成熟樹突細(xì)胞(dendritic cells，DC)表面均有高表達(dá)(94%～98%)，可幫助DC高效地?cái)z取﹑加工處理和遞呈抗原，在機(jī)體免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵的引導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用[9]。CD47可以通過與信號調(diào)節(jié)蛋白α(signalregulatoryproteinα，SIRPα)﹑受體整合素及凝血酶敏感蛋白結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡﹑增殖﹑黏附和遷移等[10]。CD47分子作用復(fù)雜，不僅介導(dǎo)吞噬白細(xì)胞凋亡﹑合成細(xì)胞因子[11]，還可與白細(xì)胞受體αMβ2(CD11b/CD18)結(jié)合而促進(jìn)T細(xì)胞活化及白細(xì)胞從血管內(nèi)向炎癥部位浸潤[12]。國外研究發(fā)現(xiàn)，CD47缺陷小鼠易產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[13]。Cázares-Delgadillo等[14]研究發(fā)現(xiàn)CD47表達(dá)的變化與MODSE和炎癥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，即CD47低表達(dá)患者M(jìn)ODSE的發(fā)生率較高。本研究結(jié)果提示，治療組在rhGH的干預(yù)下CD47表達(dá)增高，患者的炎癥反應(yīng)得到明顯改善，并發(fā)多種感染的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，其機(jī)制可能為CD47有效介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-12(IL-12)﹑腫瘤壞死因子-α(TNF-α)﹑干擾素-γ(IFN-γ)的釋放[15]，而rhGH顯著增高CD47的表達(dá)，進(jìn)而減少炎癥遞質(zhì)的合成和釋放。CD47作為一種重要的免疫因子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，本實(shí)驗(yàn)中rhGH治療組患者免疫功能的提高與CD47表達(dá)增高后影響DC的成熟有關(guān)。在rhGH作用下，CD47表達(dá)增高促使DC保持在未成熟狀態(tài)，從而限制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間；CD47表達(dá)增高也可使中性粒細(xì)胞﹑單核細(xì)胞等由接觸抗原的外周組織跨膜遷移進(jìn)入次級淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答，達(dá)到維持機(jī)體免疫水平的目的。此外，Seo等[16]報(bào)道外源性的rhGH可直接刺激B細(xì)胞合成免疫球蛋白，且在促進(jìn)機(jī)體淋巴細(xì)胞DNA合成方面具有重要作用，進(jìn)而影響胸腺﹑骨髓的成熟及分化，在改善患者整體狀況的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高免疫功能，但其具體作用靶點(diǎn)仍須進(jìn)一步研究。

L-選擇素是一種細(xì)胞黏附分子，只表達(dá)于白細(xì)胞，對白細(xì)胞黏附具有關(guān)鍵的介導(dǎo)作用，其mRNA穩(wěn)定地表達(dá)于T細(xì)胞，有絲分裂原刺激后可增加其表達(dá)量。在細(xì)胞激活過程中，L-選擇素表達(dá)變化迅速，這種變化既發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，亦發(fā)生在翻譯水平。L-選擇素在創(chuàng)傷過程﹑休克反應(yīng)﹑膿毒血癥中起著重要作用，最新研究結(jié)果表明，L-選擇素和MODSE密切相關(guān)[17]。休克反應(yīng)時(shí)，白細(xì)胞嵌塞毛細(xì)血管，引起血流停止；治療后，當(dāng)灌流壓恢復(fù)時(shí)，仍可有白細(xì)胞嵌塞，因此它是無復(fù)流的原因之一。白細(xì)胞在臟器中被截留俘獲，進(jìn)而損害實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是休克后期引起多器官功能衰竭的機(jī)制之一[18]。L-選擇素與其配體或者抗體的交聯(lián)能增強(qiáng)TNF-α和IL-8的表達(dá)[19]，此外，L-選擇素與其抗體結(jié)合能夠引起具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)作用的CSF-1基因的表達(dá)[20]。有研究表明，rhGH可抑制黏附分子(ICAM-1)蛋白的表達(dá)[21]，但與ICAM-1同為黏附分子的L-選擇素與rhGH之間的作用關(guān)系尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中MODSE患者經(jīng)過治療后，L-選擇素水平顯著降低(P＜0.01)，患者免疫功能提高，其機(jī)制可能為：①可溶性L-選擇素是L-選擇素在白細(xì)胞表面脫落的部分，與臨床疾病密切相關(guān)，在機(jī)體中起負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié)作用，rhGH抑制可溶性L-選擇素的生成；②rhGH通過作用于L-選擇素而增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的功能和促進(jìn)T淋巴細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育；③rhGH可阻斷L-選擇素與其內(nèi)皮配體的結(jié)合，從而減少白細(xì)胞趨化黏附于活化的內(nèi)皮細(xì)胞。

AOPPs是蛋白質(zhì)氧化修飾的產(chǎn)物，在體內(nèi)發(fā)揮炎癥介質(zhì)作用，是評價(jià)氧化應(yīng)激的特異性﹑靈敏度和預(yù)后評估的有效指標(biāo)。AOPPs與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)，外源性AOPPs可促進(jìn)單核細(xì)胞分泌TNF-α，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化因子[22]，AOPPs水平異常增高提示患者機(jī)體發(fā)生了嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，甚至誘發(fā)一系列相關(guān)臟器的損傷，加快MODSE的進(jìn)展。熊艷等[23]﹑Kremidas等[24]前期臨床研究發(fā)現(xiàn)AOPPs參與了MODSE的發(fā)病過程，可作為判斷MODSE器官功能障礙程度和預(yù)后的重要指標(biāo)，Yuan等[25]報(bào)道rhGH能通過增加抗氧化分子水平﹑降低自由基活化程度而明顯改善患者的負(fù)氮平衡及預(yù)后。Van den Berg等[26]研究發(fā)現(xiàn)，rhGH可抑制TNF-α的生成和釋放，抑制敗血癥大鼠血漿中iNOS的活力，從而降低NO水平。本實(shí)驗(yàn)中，rhGH治療組AOPPs濃度較對照組明顯降低，表明rhGH可減輕MODSE患者的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制可能如下：①腸黏膜屏障在應(yīng)激狀態(tài)下會出現(xiàn)功能障礙，從而使細(xì)菌移位，內(nèi)毒素﹑細(xì)菌透過屏障入血，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，使機(jī)體功能進(jìn)一步紊亂，成為觸發(fā)MODSE的主要原因。rhGH可發(fā)揮對腸黏膜的保護(hù)作用，增強(qiáng)機(jī)體的防御能力，減輕內(nèi)毒素對肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的刺激，改善臟器微循環(huán)，降低多器官炎癥反應(yīng)。②rhGH具有防止抗炎介質(zhì)水平下降﹑維持抗炎介質(zhì)水平的作用[27]。

從本研究可看出，rhGH可調(diào)節(jié)MODSE患者機(jī)體的膜糖蛋白﹑黏附因子及蛋白氧化應(yīng)激，從而改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂，改善患者的不良狀況和預(yù)后，為rhGH在臨床危重患者中的使用提供了一定的依據(jù)。但由于本研究無大樣本的數(shù)據(jù)，臨床療效尚需進(jìn)一步證實(shí)。

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