活性氧介導(dǎo)的鐵過載對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討

沈繼春，張宇辰，趙明峰

·基礎(chǔ)研究·

活性氧介導(dǎo)的鐵過載對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討

沈繼春，張宇辰，趙明峰

目的建立小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)鐵過載(IO)模型，并對(duì)鐵過載模型小鼠進(jìn)行去鐵及抗氧化治療，探討鐵過載對(duì)小鼠BM-MSCs的損傷作用及活性氧(ROS)在該損傷中的作用機(jī)制。方法采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將40只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、鐵劑(右旋糖酐鐵，25mg/ml)組(IO組)、鐵劑＋去鐵治療(DFX，125mg/kg)組(Fe+DFX組)、鐵劑＋抗氧化治療(NAC，40mmol/L)組(Fe+NAC組)，每組10只。從小鼠密質(zhì)骨中分離BM-MSCs培養(yǎng)至P1代，檢測(cè)BM-MSCs內(nèi)鐵顆粒、不穩(wěn)定鐵(LIP)及ROS水平；利用倍增時(shí)間及CCK-8試劑盒檢測(cè)BM-MSCs增殖情況；采用堿性磷酸酶染色(ALP)、茜素紅染色、成骨分化基因檢測(cè)等方法評(píng)估BM-MSCs成骨分化能力；采用油紅O染色檢測(cè)BM-MSCs成脂定向分化能力。結(jié)果與對(duì)照組相比，鐵劑組BM-MSCs內(nèi)存在明顯鐵顆粒，LIP及ROS水平明顯增高(P<0.05)，倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)(2.07±0.14dvs1.03±0.07d，P<0.01)。DFX組及NAC組倍增時(shí)間較鐵劑組有所縮短，分別為1.52±0.07d與1.68±0.03d(P<0.05)。與對(duì)照組比較，鐵劑組BM-MSCs礦化能力及向成骨細(xì)胞分化能力下降，成骨基因ALP、RUNX2、OSN表達(dá)增強(qiáng)，而成脂定向分化能力增強(qiáng)。在去鐵及抗氧化治療后，上述改變發(fā)生部分逆轉(zhuǎn)。結(jié)論鐵過載可影響小鼠骨髓MSCs的增殖及定向分化能力，其機(jī)制可能與鐵過載所致ROS升高有關(guān)。

鐵超負(fù)荷；間質(zhì)干細(xì)胞；活性氧

鐵過載是指鐵在體內(nèi)過度沉積導(dǎo)致重要臟器的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙[1]。鐵過載分為原發(fā)性(遺傳性血色病)和繼發(fā)性(長(zhǎng)期紅細(xì)胞輸注所致的鐵過載)兩種[2]。近年來一些臨床數(shù)據(jù)表明，鐵過載會(huì)對(duì)骨髓造血功能產(chǎn)生明顯影響，去鐵治療可使部分鐵過載患者(骨髓纖維化、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征)的輸血次數(shù)減少甚至脫離輸血，表明鐵過載可抑制骨髓造血功能，體外實(shí)驗(yàn)顯示這種抑制作用是通過增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生影響骨髓造血干祖細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)的[3-10]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，具有干細(xì)胞特性及多向分化能力，同時(shí)可分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血功能[10-11]。對(duì)體外MSCs鐵過載模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，鐵過載可通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平抑制MSCs增殖、誘導(dǎo)其凋亡，從而降低其造血支持能力[12-13]。本研究旨在建立MSCs鐵過載動(dòng)物模型，為探索鐵過載對(duì)骨髓造血微環(huán)境的影響及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為治療鐵過載提供方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6純系小鼠，6～8周齡，SPF級(jí)，由中國(guó)食品藥品鑒定研究院北京鑒定所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 TH4-200型熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter Altra產(chǎn)品。右旋糖酐鐵注射液購(gòu)自丹麥Pharmacocmos公司，胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，鈣熒光素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)、油紅O染液(oil-red-O)、茜素紅染液(alizarin red S)、堿性磷酸酶試劑盒(ALP kit)、L-谷氨酰胺、青鏈霉素、地塞米松、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBXM)、吲哚美辛、牛胰島素、β-甘油磷酸鈉、維生素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海貝博生物技術(shù)公司，ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。基因引物均由上海生工科技有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鐵過載模型建立 利用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，將40只雄性C57BL/6小鼠分為對(duì)照組、鐵劑組(右旋糖酐鐵，25mg/ml)、鐵劑＋去鐵治療(地拉羅司，deferasirox，DFX，125mg/kg)組(Fe+DFX組)及鐵劑＋抗氧化(N-乙酰半胱氨酸，NAC，40mmol/L)組(Fe+NAC組)。對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水0.2ml/次；鐵劑組小鼠腹腔注射右旋糖酐鐵0.2ml/次，1次/3d；去鐵治療組小鼠予口服灌胃DFX 125mg/ kg，每周5d；抗氧化治療組小鼠通過飲用水服用NAC 40mmol/L，每周換水2次。鐵劑、去鐵及抗氧化藥物共給予4周。

1.3.2 MSCs的分離及培養(yǎng) 處理4周后，小鼠脫頸處死，浸泡于75%乙醇中2min后，轉(zhuǎn)入100mm無菌平皿，切開下肢皮膚，用組織剪盡可能分離干凈附著在股骨和脛骨上的肌肉、韌帶。根據(jù)文獻(xiàn)[14]方法從密質(zhì)骨中分離培養(yǎng)MSCs：將骨組織置入35mm無菌平皿中，加入5ml培養(yǎng)液(α-MEM+1%P/ S+2%FBS)，為保持MSCs細(xì)胞活性，操作不宜超過2h。剪去骨兩端的骨骺，沖洗髓腔內(nèi)造血細(xì)胞，沖洗至髓腔變白。將骨組織剪成1～3mm3大小顆粒，轉(zhuǎn)至25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α-MEM(含1mg/ml膠原酶Ⅱ)4ml，37℃振搖1～2h。回收消化松散的骨片進(jìn)行原代培養(yǎng)。將經(jīng)上述分離所得的骨片種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入5ml完全培養(yǎng)基(α-MEM+10%FBS+1%P/S)，在37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3d，在此期間避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以便細(xì)胞附壁生長(zhǎng)。3d后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，之后隔天換液，5d后細(xì)胞融合達(dá)80%，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化3min，加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，離心重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用于下一步實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 MSCs鐵過載鑒定 調(diào)整P1代MSCs細(xì)胞濃度為1×106/ml，將細(xì)胞懸液混勻，取100μl，加入已用PBS浸潤(rùn)的甩片架上，利用甩片機(jī)進(jìn)行甩片(900r/min，5min)，之后用95%乙醇固定15min，進(jìn)行普魯士藍(lán)鐵染色，觀察細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒。利用不穩(wěn)定鐵(LIP)可以淬滅鈣熒光素乙酰氧基甲酯的原理檢測(cè)MSCs內(nèi)的LIP水平，將用胰酶消化的P1代細(xì)胞用PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞于PBS中，加入鈣熒光素乙酰氧基甲酯，使其終濃度為0.125μmol/L，37℃避光溫育15min，用PBS洗滌2次后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.3.4 MSCs增殖能力檢測(cè) 群體倍增時(shí)間：將MSCs傳至P1代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/孔密度接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37℃孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用胰酶消化計(jì)數(shù)。按以下公式計(jì)算BM-MSCs的倍增時(shí)間(doubling time，DT)：DT=CT×lg2/lg(X1/X0)，其中X0是細(xì)胞的最初數(shù)量，X1是細(xì)胞的最終數(shù)量，CT是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，步驟為：將濃度為2.5×104的細(xì)胞，倍比稀釋為4個(gè)濃度梯度，分別為2.5×104/孔、1.25×104/孔、0.75×104/孔、0.375×104/孔，接種于96孔板中，每孔200μl，48h后，加8μl CCK-8試劑，37℃孵育3h后利用分光光度儀測(cè)定450nm及610nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。

1.3.5 MSCs成骨誘導(dǎo)及鑒定 將原代BM-MSCs用胰酶消化，以5×104/孔密度接種于24孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至板底70%～80%時(shí)，更換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑(10%FBS、10-8mol/L地塞米松、50μmol/L抗壞血酸磷酸鹽、10μg/ml胰島素、10mmol/L β-磷酸甘油、1%雙抗)。每周換液2次，14d后用ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)BM-MSCs染色情況檢測(cè)ALP積分。繼續(xù)培養(yǎng)14d，采用茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化能力。將各組BM-MSCs用胰酶消化，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因(RUNX2，ALP，OSX，COLI)的表達(dá)量。

1.3.6 BM-MSCs成脂誘導(dǎo)及鑒定 將原代BMMSCs用胰酶消化，以2×104/孔密度接種于24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至板底70%～80%時(shí)，更換為成脂誘導(dǎo)完全分化培養(yǎng)基，按照說明書進(jìn)行誘導(dǎo)，細(xì)胞在培養(yǎng)過程中無須傳代，15d后進(jìn)行油紅O染色鑒定。

1.3.7 ROS測(cè)定及相關(guān)信號(hào)通路檢測(cè) 2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(dichloro fl uorescindiacetate，DCFH-DA)為非熒光脂類可滲透性成分，能被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成非滲透性熒光成分DCF，故DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正比。收集1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌、重懸，加入10mmol/L的DCFH-DA，使其終濃度為1μmol/L，37℃避光溫育20min，PBS洗滌3次，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。將各組原代BM-MSCs用胰酶消化，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因(FOXO3，PI3K)的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài) 原代培養(yǎng)48h后可見類圓形細(xì)胞從骨片中爬出，呈貼壁生長(zhǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24h后可見更多細(xì)胞爬出環(huán)繞骨片，培養(yǎng)72h后有集落形成，細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形。培養(yǎng)7d后，細(xì)胞融合達(dá)80%(圖1)。

圖1 密質(zhì)骨分離的間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 Morphology of BM-MSCs isolated from compact bone

2.2 MSCs多向分化能力鑒定 將MSCs傳至P1代，放入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成骨誘導(dǎo)28d后進(jìn)行茜素紅染色，成脂誘導(dǎo)20d后進(jìn)行油紅-O染色，鑒定結(jié)果顯示MSC分化為成骨及成脂細(xì)胞(圖2)。

圖2 BM-MSCs 的成骨及成脂分化鑒定(×400)Fig. 2 Identity of the osteoblastic and adipogenic differentation ability of BM-MSCs (×400)

2.3 MSCs鐵過載鑒定 鐵染色可見IO組細(xì)胞內(nèi)存在大量鐵顆粒，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)幾乎無鐵顆粒(圖3A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LIP結(jié)果顯示：IO組MFI明顯低于對(duì)照組(33 357±678vs56 282±813)，進(jìn)行去鐵及抗氧化治療后，細(xì)胞內(nèi)熒光猝滅減少，LIP減少。DFX組MFI值(50 687±475)及NAC組MFI值(35 722±592)較IO組回升且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3B)。

2.4 鐵過載抑制MSCs增殖 將P1代MSCs以1×105/孔密度接種于6孔板中培養(yǎng)，計(jì)算倍增時(shí)間，比較各組細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，IO組細(xì)胞增殖能力明顯下降。IO組倍增時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組(2.07±0.14dvs1.03±0.17d)，在進(jìn)行去鐵及抗氧化治療后，BM-MSCs的倍增時(shí)間較IO組縮短(Fe+DFX組1.52±0.07d，F(xiàn)e+NAC組1.68±0.03d，圖4A)。此外，利用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖得到了相同的結(jié)果，IO組增殖能力較對(duì)照組明顯下降(0.977±0.075vs1.349±0.089)。在進(jìn)行去鐵及抗氧化治療后，BM-MSCs增殖能力有所回升，F(xiàn)e+DFX組吸光度為1.162±0.051，F(xiàn)e+NAC組吸光度為1.163±0.054，二組較IO組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

圖3 BM-MSCs鐵過載模型的鑒定Fig. 3 Identity of BM-MSCs iron deposit by Perl's iron staining

圖4 各組倍增時(shí)間及吸光度比較Fig. 4 Comparison of doubling time and absorbency value of each group

2.5 鐵過載對(duì)BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化的抑制作用 將細(xì)胞以5×104/孔密度接種于24孔板中，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周可見有纖維狀細(xì)胞開始變圓，培養(yǎng)2周時(shí)，可見細(xì)胞由單一梭形變?yōu)槎嘟切?、圓形，各組細(xì)胞密度不同。此時(shí)成骨細(xì)胞分泌的ALP達(dá)到高峰，ALP試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，IO組ALP活性低于對(duì)照組(185±7vs253±18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5A)。茜素紅染色可見IO組染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(圖5B)。Realtime PCR檢測(cè)顯示，IO組成骨基因ALP、RUNX2及OSN表達(dá)降低，分別為對(duì)照組的0.383±0.025倍、0.336±0.045倍、0.830±0.091倍。去鐵及抗氧化治療后，ALP活性回升，分別為對(duì)照組的0.583±0.042倍及0.533±0.052倍，與IO組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；RUNX2表達(dá)也有所升高，分別為對(duì)照組的0.613±0.056倍、0.058±0.090倍，與IO組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖5C)。

2.6 鐵過載對(duì)MSCs成脂的影響 成脂誘導(dǎo)14d后進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果顯示鐵劑組脂滴明顯多于對(duì)照組，說明過量的鐵顆粒可促進(jìn)BM-MSCs向成脂細(xì)胞分化(圖6)。

2.7 鐵過載引起ROS升高及相關(guān)信號(hào)通路激活流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MSCs細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示鐵劑組ROS水平高于對(duì)照組(29 381±886vs17 836±1844)，去鐵及抗氧化治療后ROS水平有所下降，DFX組為24 065±203，NAC組為21 116±542(P<0.05，圖7)。Real-time PCR結(jié)果顯示ROS相關(guān)信號(hào)通路被激活，鐵劑組PI3K表達(dá)是對(duì)照組的1.87±0.04倍，去鐵及抗氧化治療后PI3K表達(dá)減少，分別為對(duì)照組的1.24±0.06倍及1.11±0.06倍(P<0.001)。鐵劑組ROS負(fù)調(diào)控因子FOXO3表達(dá)下降，是對(duì)照組的0.62±0.04倍，去鐵及抗氧化治療后FOXO3表達(dá)有所增加，分別為對(duì)照組的0.77±0.04倍及0.88±0.02倍(P<0.01)。

3 討 論

鐵過載(血色病)主要原因?yàn)殍F在體內(nèi)過度沉積，導(dǎo)致重要臟器(尤其是心臟、肝臟、垂體、胰腺和關(guān)節(jié))的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙，可見于遺傳性血色病等遺傳因素及紅系無效造血、長(zhǎng)期輸血等繼發(fā)因素造成的機(jī)體內(nèi)鐵吸收過多及代謝障礙。有臨床證據(jù)表明，鐵過載可以抑制骨髓造血功能[15-17]，鐵過載患者給予去鐵治療后血液學(xué)指標(biāo)明顯改善，輸血依賴減少[15,18]。在本研究小組前期建立的鐵過載動(dòng)物模型中，我們發(fā)現(xiàn)在造血微環(huán)境中有大量鐵沉積，而BM-MSCs為造血微環(huán)境的重要組成部分，因此本研究旨在探索鐵過載對(duì)小鼠BM-MSCs的影響及其可能機(jī)制。

圖5 鐵過載對(duì)BM-MSCs 成骨分化的影響Fig. 5 IO influence the osteogenic differentiation of BM-MSCs

圖6 油紅O染色鑒定BM-MSCs成脂能力(×400)Fig. 6 Adipogenesis of BM-MSCs (Oil-red-O staining ×400)

BM-MSCs通過與造血細(xì)胞直接接觸、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及多種細(xì)胞因子來維持造血微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能的完整性，對(duì)造血進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。同時(shí)MSCs自身也具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化的能力。本研究根據(jù)密質(zhì)骨及其骨內(nèi)膜富含間充質(zhì)干細(xì)胞這一特性，從密質(zhì)骨中提取MSCs，將細(xì)胞分離培養(yǎng)至P1代，進(jìn)行細(xì)胞甩片普魯士藍(lán)鐵染色，發(fā)現(xiàn)鐵劑組間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)存在大量鐵顆粒，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LIP也得出類似結(jié)果，證明小鼠MSCs鐵過載模型構(gòu)建成功。

圖7 鐵過載對(duì)BM-MSCs中ROS、FOXO3及PI3K表達(dá)的影響Fig. 7 IO increased the ROS expression in BM-MSCsviaaffecting the expression of FOXO3and PI3K

本課題組前期體外研究證實(shí)，鐵過載可致ROS水平升高而損傷人骨髓及臍帶MSCs，機(jī)制包括抑制MSCs的增殖、促進(jìn)其衰老及凋亡[19-20]。本研究在小鼠骨髓MSCs鐵過載模型中也發(fā)現(xiàn)了相同結(jié)果：對(duì)照組小鼠MSCs表現(xiàn)出旺盛的增殖能力，而鐵劑組小鼠MSCs增殖能力明顯下降。此外，鐵過載可抑制小鼠骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化。將小鼠骨髓MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，鐵劑組誘導(dǎo)形成的成骨細(xì)胞內(nèi)ALP含量明顯低于對(duì)照組，茜素紅染色可見鐵劑組陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組。MSCs向成骨細(xì)胞分化過程可以分為細(xì)胞增殖期、基質(zhì)成熟期和礦化期，成骨細(xì)胞在上述時(shí)期分別優(yōu)勢(shì)性表達(dá)ALP、骨鈣素(OCN)、Ⅰ型膠原(COLⅠ)等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，因此，觀察這些蛋白的表達(dá)情況，可以在一定程度上反映成骨細(xì)胞分化成熟的階段。ALP在成骨分化的早期分泌，在基質(zhì)成熟期分泌量達(dá)高峰，是骨質(zhì)鈣化、礦化必需的因子。RUNX2是成骨細(xì)胞分化過程中主要的因子之一，具有調(diào)節(jié)成骨及成脂平衡等重要作用。

本研究結(jié)果表明，鐵過載可以抑制小鼠BMMSCs增殖，影響其成骨及成脂分化平衡，其機(jī)制可能為胞質(zhì)內(nèi)聚集的大量自由鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss途徑催化生成大量ROS[21]。本研究利用DCFH-DA探針檢測(cè)鐵過載BM-MSCs內(nèi)的ROS含量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平與細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒數(shù)目呈正比，與本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。大量文獻(xiàn)報(bào)道，ROS升高可抑制成骨細(xì)胞相關(guān)基因(RUNX2、COLⅠ、ALP等)的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞形成[22]，其機(jī)制可能是由于ROS下調(diào)細(xì)胞內(nèi)FOXO相關(guān)因子的表達(dá)，而FOXO相關(guān)因子在氧化還原平衡及骨形成過程中發(fā)揮重要作用[23]。因此，鐵過載抑制BM-MSCs向成骨細(xì)胞分化可能與上述機(jī)制相關(guān)。

綜上所述，鐵過載可以抑制小鼠骨髓MSCs增殖，降低其向成骨細(xì)胞分化的能力，從而降低其造血支持能力，損傷骨髓造血功能，其機(jī)制主要與ROS升高相關(guān)。

[1] Cao XL, Zhao MF. Organ dysfunction of Iron overload and magnetic resonance imaging for the detection of Iron Overload Research[J]. Chin J Pract Intern Med, 2014, 34(12): 1226-1228. [曹小立, 趙明峰. 鐵過載對(duì)器官功能損傷及磁共振檢測(cè)鐵過載研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2014, 34(12): 1226-1228.]

[2] The Chinese Medical Association Society of Blood. China expert consensus about diagnosis and treatment of iron overload[J]. Chin J Hematol, 2011, 32(8): 572-574. [中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì). 鐵過載診斷與治療的中國(guó)專家共識(shí)[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2011, 32(8): 572-574.]

[3] Chai X, Zhao MF. The damage and treat development of iron overload in hematological diseases[J]. Chin J Intern Med, 2013, 52(5): 431-433. [柴笑, 趙明峰. 鐵過載在血液系統(tǒng)疾病中的危害及治療進(jìn)展[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2013, 52(5): 431-433.]

[4] Guariqlia R, Martorelli MC, Villani O,et al. Positive effect on hematopoiesis in patients with myelodysplastic sydrome receiving deferasirox as oral iron chelation therapy: a brief review[J]. Leuk Res, 2011, 35(5): 566-570.

[5] Zhao MF, Xie F, Li YM,et al. Increased intracellular concentration of reactive oxygen species mediated the deficient hematopoiesis of iron overload bone marrow[J]. Blood, 2010, 116(11): 4247a.

[6] Xie F, Zhao MF, Li YM,et al.In vitroe ff ect of iron overload on bone marrow cell function by inducing the reactive oxygen species[J]. Chin J Hematol, 2011, 32(9): 606-609. [謝芳, 趙明峰, 李玉明,等. 鐵過載誘導(dǎo)活性氧物質(zhì)生成對(duì)骨髓造血功能影響的體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2011, 32(9): 606-609.]

[7] Xie F, Zhao MF, Zhu HB,et al. Establishment of iron overloaded bone marrow modelin vitroand its impact on hematopoiesis[J]. J Exp Hematol, 2011, 19(4): 1038-1042. [謝芳, 趙明峰, 朱海波, 等. 鐵過載骨髓造血細(xì)胞體外模型的建立及其對(duì)造血的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2011, 19(4): 1038-1042.]

[8] Xie F, Zhao MF, Zhu HB,et al. The e ff ect of iron-catalyzed oxidative stress to hematoposis of hematopoietic stem and progenitor cell[J]. Natl Med J Chin, 2011, 91(46): 3284-3288. [謝芳, 趙明峰, 朱海波, 等. 氧化應(yīng)激對(duì)鐵過載造血干祖細(xì)胞造血功能的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 91(46): 3284-3288.]

[9] Taoka K, Kumano K, Nakamura F,et al. The effect of iron oveload and chelation on erythroid differentiation[J]. Int J Hematol, 2012, 95(2): 149-159.

[10] Shi M, Liu ZW, Zhang Z,et al. Progress and challenge in the treatment of end-stage liver disease with stem cells[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(8): 685-692. [施明, 劉振文, 張政, 等. 干細(xì)胞治療終末期肝病的進(jìn)展與挑戰(zhàn)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(8): 685-692.]

[11] Lu XC, Yang B, Chi XH,et al. A novel etiology of aplastic anemia: the uncontrolled adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells in bone marrow induced by an abnormal immunological reaction[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(3): 173-179. [盧學(xué)春, 楊波, 遲小華, 等. 再生障礙性貧血病因?qū)W的新探索:異常免疫誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的過度脂肪化(英文)[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 39(3): 173-179.]

[12] Lu WY, Zhao MF, Sajin R,et al. Effect and mechanism of ironcatalyzed oxidative stress on mesenchymal stem cells[J]. Acta Acad Med Sin, 2013, 35(1): 6-12. [盧文藝, 趙明峰, Sajin Rajbhandary,等. 鐵過載催化的氧化應(yīng)激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 35(1): 6-12.]

[13] Lu WY, Zhao MF, Chai X,et al. Reactive oxygen species mediate the inury and de fi cient hematopoietic supportive capacity of umbilical cord derived mesenchymal stem cells induced by iron overload[J]. Natl Med J Chin, 2013, 93(12): 930-934. [盧文藝, 趙明峰, 柴笑,等. 活性氧介導(dǎo)鐵過載對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其造血支持作用的研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 93(12): 930-934.]

[14] Zhu H, Guo ZK, Jiang XX,et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone[J]. Nat Protoc, 2010, 5(3): 550-560.

[15] Hartmann J, Braulke F, Sinzig U,et al. Iron overload impairs proliferation of erythroid progenitors cells (BFU-E) from patients with myelodysplastic syndromes[J]. Leuk Res, 2013, 37(3): 327-332.

[16] Oliva EN, Ronco F, Marino A,et al. Iron chelation therapy associated with improvement of hematopoiesis in transfusiondependent patients[J]. Transfusion, 2010, 50(7): 1568-1570.

[17] Gattermann N, Finelli C, Della Porta M,et al. Hematologic responses to deferasirox therapy in transfusion dependent patients with myelodysplastic syndromes[J]. Haematologica, 2012, 7(9): 1364-1371.

[18] Ho JH, Chen YF, Ma WH,et al. Cell contact accelerates replicative senescence of human mesenchymal stem cells independent oftelomere shortening and p53 activation: roles of Ras and oxidative stress[J]. Cell Transplant, 2011, 20(8): 1209-1220.

[19] Ko E, IJee KY, Hwang DS. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells undergo cellular senescence in response to oxidative stress[J]. Stem Cells Dev, 2012, 21(11): 1877-1886.

[20] Kanda Y, Hinata T, Kang SW,et al. Reactive oxygen species mediate adipocyte differentiation in mesenchymal stem cells[J]. Life Sci, 2011, 89(7/8): 250-258.

[21] Valko M, Morris H, Cronin MT. Metals, toxicity and oxidative stress[J]. Curr Med Chem, 2005, 12(10): 1161-1208.

[22] Suh KS, Rhee SY, Jung WW,et al. Chrysanthemum zawadskii extract protects osteoblastic cells from highly reducing sugar-induced oxidative damage[J]. Int J Mol Med, 2013, 32(1): 241-250.

[23] Kim KM, Park SJ, Jung SH,et al. MiR-182 is a negative regulator of osteoblast proliferation, differentiation, and skeletogenesis through targeting FoxO1[J]. J Bone Miner Res, 2012, 27(8): 1669-1679.

Effect of reactive oxygen species mediated iron overload on murine bone marrow mesenchymal stem cells and its mechanism

SHEN Ji-chun1, ZHANG Yu-chen2, ZHAO Ming-feng2*1Department of Hematology, Affiliated Hospital of Logistics University of People’s Armed Police Forces, Tianjin 300162, China
2Department of Hematology, The First Central Clinical College of Tianjin Medical University, Tianjin 300192, China

*Corresponding author, E-mail: zmfzmf@hotmail.com

This work was supported by the Natural Science Foundation of China (81041043), Natural Science Foundation of Tianjin (13JCYBJC23400), and Science and Technology Foundation of Tianjin Health Bureau(2013KR07)

ObjectiveTo reproduce an iron overload (IO) model of murine bone marrow derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs), explore the effects of IO on murine BM-MSCs, and elucidate the involvement of reactive oxygen species (ROS) in this process.MethodsForty male mice (C57BL/6) were randomly divided into 4 groups (n=10): control group, IO group, Fe+iron-chelation (DFX, 125mg/kg) group and Fe+anti-oxidation (NAC, 40mmol/L) group. BM-MSCs were isolated from compact bone. The levels of iron particles, labile iron pool (LIP) and ROS in BM-MSCs were measured to confirm oxidative stress in the model. Cell proliferation was measured through population double time (DT) and by Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay. The osteoblastic differentiation ability of BM-MSCs was assessed by alkaline phosphatase (ALP) activity, alizarin red staining and osteogenic differential genes assay. The adipogenic differentiation ability of BM-MSCs was detected by Oil-Red-O staining.ResultsCompared with control group, iron deposite increased significantly with higher levels of LIP and ROS in BM-MSCs of IO group (P<0.05). In IO group, the BM-MSCs showed a longer double time than that in control group (2.07±0.14dvs1.03±0.07d), which can be reversed to 1.52±0.07d by DFX or to 1.68±0.03d by NAC (P<0.05). IO inhibited osteogenic differentiation and mineralization of BM-MSCs, which could be attributed to decreased expression of osteogenic gene alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and osteocalcin (OSN). The osteoblastic differentiation ability of BM-MSCs in IOgroup was suppressed by IO-induced ROS upregulation. NAC or DFX treatment could partially a tt enuate cell injury and inhibit the signaling pathway induced by excessive iron.ConclusionIO may impair the proliferation and di ff eretiation ability of murine BM-MSCs by enhancing the generation of ROS.

iron overload; mesenchymal stem cells; reactive oxygen species

R551.3

A

0577-7402(2015)02-0097-07

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.02.03

2014-10-17；返回日期：2014-12-30)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

國(guó)家自然科學(xué)基金(81041043)；天津市自然科學(xué)基金(13JCYBJC23400)；天津市衛(wèi)生局科技基金(2013KR07)

沈繼春，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，副教授。主要從事貧血、出凝血疾病及白血病方面的研究

300162 天津 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院血液科(沈繼春)；300192 天津醫(yī)科大學(xué)第一中心臨床學(xué)院血液科(張宇辰、趙明峰)

趙明峰，E-mail: zmfzmf@hotmail.com