• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CD133陽性/陰性肺癌細胞的分選、鑒定及差異基因的篩選

    2015-08-27 13:51:30鄭少秋李書華王紅艷謝曉斌張雅潔
    中國肺癌雜志 2015年3期
    關鍵詞:陽性細胞腺癌克隆

    鄭少秋 李書華 王紅艷 謝曉斌 張雅潔

    腫瘤轉移和復發(fā)是惡性腫瘤臨床治療失敗及患者死亡的主要原因,腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)是導致腫瘤發(fā)生轉移、復發(fā)的關鍵所在[1]。

    目前,人們已經分離出乳腺癌干細胞,并證實腦良性和惡性腫瘤、惡性黑色素瘤細胞系、結腸癌、肝癌、前列腺癌等實體瘤中存在CSCs[2-4]。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤,研究[5,6]表明肺癌中存在CSCs,CD133可能是肺癌干細胞的標記物。本研究擬通過MACS的方法對肺癌細胞株A549中的CD133陽性細胞及CD133陰性細胞進行分選,并對其生物學特性進行鑒定。在此基礎上,利用基因芯片對CD133陽性/陰性細胞進行對比檢測,篩選轉移相關的差異基因,旨在為腫瘤轉移機制的研究提供新線索,為肺癌的基因治療提供新靶點。

    1 材料和方法

    1.1 組織標本 收集廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自2005年1月-2008年12月手術切除的81例肺癌石蠟包埋組織(患者術前均未接受化療和放療),患者年齡最大81歲,最小29歲,中位年齡50歲。根據2004年世界衛(wèi)生組織肺癌組織分類標準進行分類,81例肺癌組織中鱗癌29例,腺癌34例,大細胞癌、腺鱗癌、肉瘤樣癌各4例,小細胞癌6例;臨床分期I期28例,II期21例,III期27例,IV期5例;伴淋巴結轉移者43例,無轉移者38例。同時收集10例正常肺組織。

    1.2 細胞培養(yǎng) 肺腺癌A549細胞系來源于ATCC,引自廣州醫(yī)學院中心實驗室。采用含10%新生牛血清(Gibco)RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3天更換培養(yǎng)液。細胞密度為80%-100%時,0.25%胰酶-EDTA消化液消化后,1:3傳代。

    1.3 細胞分選 分別采用陽性分選柱(MS柱)和陰性分選柱(LD柱)分選CD133陽性細胞及CD133陰性細胞:A549細胞在75 cm3培養(yǎng)瓶中生長達80%融合時,0.25%胰酶EDTA消化液消化后,收獲單細胞懸液,計數細胞,取≤108個細胞過柱進行分選,步驟按試劑盒(Miltenyi)說明書進行。

    1.4 免疫熒光技術檢測細胞純度 取經分選細胞(CD133陽性細胞、CD133陰性細胞)制備細胞涂片,利用PE標記CD133-2(Miltenyi)抗體進行免疫熒光檢測,步驟按試劑盒說明進行。熒光顯微鏡觀察,細胞呈現明亮紅色熒光為陽性。

    1.5 “sphere”形成實驗及誘導分化實驗 取等量的CD133陽性細胞及CD133陰性細胞按1,000個/mL的比例置于添加了10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子,20 mg/mL表皮生長因子,50 mg/mL胰島素,100 mg/mL脫鐵轉鐵蛋白,10 mg/mL腐胺,0.03 mmol/L亞硒酸鈉,2 mmol/L黃體酮,0.6%葡萄糖,5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸,1%碳酸氫鈉,0.4%牛血清白蛋白及谷氨酰胺的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),待培養(yǎng)基變黃進行換液;取培養(yǎng)形成的“sphere”加入含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM-F12(Gibco)培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細胞貼壁或培基變黃進行換液。

    1.6 免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC) 采用二步法進行CD133、CK7染色,步驟按試劑盒說明進行。對照設置:用PBS代替一抗作為陰性對照,選已知陽性病例作陽性對照。腫瘤細胞胞漿與胞膜呈現棕褐色為陽性。

    1.7 平板克隆實驗 選用12孔板,CD133陽性細胞、CD133陰性細胞、未分選細胞單細胞懸液(50個/孔)加入含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養(yǎng),顯微鏡觀察并計數大于50個細胞的克隆數,然后計算克隆形成率??寺⌒纬陕剩?)=(克隆數/接種細胞數)×100%。

    1.8 基因芯片檢測轉移相關差異基因 采用SuperArray第二代功能分類基因芯片對CD133陽性細胞及CD133陰性細胞(原代)分別進行腫瘤轉移基因(84個轉移相關基因)的對比檢測,結合生物信息學技術分析兩組之間的差異基因。按常規(guī)方法提取CD133陽性細胞(實驗組)及CD133陰性細胞(對照組)的RNA,合成cDNA、熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, RTFQ PCR)操作分別按照RT2 PCR Array First Strand Kit-C03、PCR Array試劑盒說明書進行操作。數據分析采用ΔΔCt方法。

    1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。兩樣本構成比(率)比較采用χ2檢驗,兩組間均數比較采用t檢驗,多組間均數比較用單因素方差分析(Student Newman Keuls, SNK)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 IHC結果 肺癌組織中CD133陽性腫瘤細胞呈分散或小灶狀/巢狀分布于癌巢邊緣,數量稀少。81例肺癌標本CD133表達陽性率為53.1%(43/81),CD133表達與各組織學類型的關系分析顯示:鱗癌、腺癌及其他類型陽性率分別為48.3%(14/29)、52.9%(18/34)和61.1%(11/18),CD133的表達與組織學類型無關(P>0.05)(表1,圖1A-圖1B);與腫瘤分級及臨床分期無關(P>0.05)。10例正常肺組織中均未見CD133陽性細胞。人肺腺癌A549細胞株中有CD133陽性細胞存在,數量稀少(圖2)。

    2.2 MACS分選結果 從人肺腺癌A549細胞株中分選出CD133陽性細胞比例約為0.2%。分選獲得的CD133陽性細胞中絕大部分細胞發(fā)明亮紅色熒光(圖3),CD133陰性細胞中僅見少量細胞發(fā)微弱紅色熒光,表明MACS分選所獲得細胞純度較高。

    2.3 “sphere”形成及誘導分化實驗結果 CD133陽性細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成“sphere”,CD133陰性細胞培養(yǎng)8周未見“sphere”形成;“sphere”加入含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)呈現貼壁生長,誘導分化前表達CD133、不表達CK7;誘導分化后CD133陰性、CK7陽性(圖4)。

    2.4 平板克隆形成實驗結果 CD133陽性細胞、CD133陰性細胞、未分選細胞組平均克隆形成率分別為57.1%、3.3%、8.7%,三組間克隆形成率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

    2.5 RNA提取 核酸定量儀檢測各組細胞總RNA的OD260/OD280均在1.7-2.0之間,說明RNA純度高;變性瓊脂糖凝膠電泳顯示28s、18s條帶清晰,前者熒光強度約為后者的兩倍,5s條帶弱,說明RNA完整、無降解。

    2.6 基因芯片檢測結果 顯示從擴增曲線可見所有樣品均已進入平臺期,說明反應條件設定準確(圖5)。CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的基因表達有顯著差異。84個轉移基因中,差異達兩倍或以上的有19個,其中差異>2倍、≤3倍的基因有14個,差異>3倍、≤4倍的基因有3個,差異>4倍、≤5倍的基因有1個,差異>5倍的基因有1個(表3)。

    表1 CD133表達與臨床病理特征的關系Tab 1 Relationship between the expression of CD133 and clinicopathological features of lung cancer

    表2 CD133陽性、CD133陰性細胞及未分選細胞的克隆形成率Tab 2 The cloning forming rates of CD133-positive cells, CD133-negative cells and unsorted cells

    表3 CD133+與CD133-細胞的腫瘤轉移相關差異基因Tab 3 Differentially expressed metastasis-related genes between CD133+ and CD133- cells

    圖1 人肺癌組織中CD133陽性表達。A:肺鱗癌二步法(EnVision,×200);B:肺腺癌二步法(EnVision,×200)Fig 1 CD133 expression of Human lung cancer tissues.A:Lung squamous cell carcinoma (EnVision, ×200); B: Lung adenocarcinoma (EnVision, ×200).

    圖2 人肺腺癌A549細胞株中CD133陽性表達(EnVision,×200)Fig 2 CD133 expression of human lung cancer cell line A549(EnVision, ×200)

    圖3 CD133陽性細胞(20×10,熒光顯微鏡)Fig 3 CD133-positive cells (20×10, Fluorescence microscopy)

    圖4 誘導分化前(A: CD133+, B: CK7-)及誘導分化后(C: CD133-, D: CK7+)Fig 4 Undifferentiated cells (A: CD133+, B: CK7-) & Differentiated cells (C: CD133-,D: CK7+)

    圖5 轉移基因熒光定量PCR擴增曲線。A:CD133陰性細胞;B:CD133陽性細胞。Fig 5 Quantitative PCR amplification of metastasis-related genes.A: CD133-negative cells; B:CD133-positive cells.

    3 討論

    CD133,又稱prominin-1/AC133抗原,是prominin家族成員之一。最初,其作為成體干細胞的標志物被大多數學者認識和接受。隨后,在包括腦腫瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、肝細胞癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌等腫瘤中發(fā)現CD133陽性的腫瘤細胞具有干細胞特性,因而CD133被認為是通用的CSCs表面標記物。為了解CD133在肺癌組織中的表達情況,我們收集了81例人肺癌組織石蠟標本進行IHC染色。在81例肺癌組織中,43例腫瘤細胞CD133呈陽性表達,但陽性細胞數量稀少,余38例腫瘤組織未見CD133陽性細胞。這一結果與Eramo[6]的報道有所不同。Eramon采用19例新鮮肺癌組織進行流式細胞術(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測,發(fā)現CD133陽性細胞的比例雖然很低,但在所有的標本中都存在CD133陽性細胞。我們認為造成這一差異的原因可能由于:①本研究所用的材料是石蠟包埋組織而非新鮮組織;②Eramon進行FACS所用的新鮮肺癌組織體積較大,而本研究用于IHC的石蠟組織只有3 μm-4 μm厚,僅僅是腫瘤組織中極小的一部分,而眾所周知CSCs數量稀少,在腫瘤組織中也只占極低的比例,因此,不能完全認為其余的38例組織中沒有CD133陽性細胞。在48例表達CD133的肺癌組織中,CD133陽性的腫瘤細胞呈小灶狀/巢狀分布。這與以前的發(fā)現[6,7]一致,有學者認為這一現象與干細胞“niche”有關。干細胞“niche”是干細胞居留的微環(huán)境,正常情況下干細胞聚居于組織器官特定的“niche”中,CSCs因保留了干細胞的特性而呈現“niche”分布現象。我們推測CD133陽性細胞在肺癌組織中呈灶狀或巢狀分布并非偶然,可能與其具有CSCs特性有關。統(tǒng)計分析CD133表達與肺癌組織學類型、腫瘤的分級及臨床分期的關系,證明均無相關性,這與報道的CSCs標記物在腫瘤組織中的表達與腫瘤病理學指標無關相一致[8]。

    在本研究中,我們采用MACS技術對人肺腺癌A549細胞株中的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞進行分選。在分選前,為明確A549細胞株中是否存在CD133陽性細胞,我們對A549細胞株進行IHC染色,結果顯示A549細胞株存在少量的CD133陽性細胞。隨后,我們對細胞進行分選,結果顯示5×106個分選前細胞經過分選獲得CD133陽性細胞數約為1×104個,CD133陽性細胞在人肺腺癌A549細胞株中所占比例極低,僅約為0.2%。我們采用熒光素(PE)標記的CD133-2抗體對分選所得細胞進行純度評估。熒光顯微鏡下觀察經分選所得的CD133陽性細胞可見細胞發(fā)明亮的紅色熒光;CD133陰性細胞中則僅見極個別發(fā)紅色熒光的細胞,考慮可能為分選過程中洗脫的陽性細胞或抗體非特異性結合顯色。由此可見,采用MACS技術能獲得高純度的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞。

    對分選所得的CD133陽性/陰性細胞進行生物學特性鑒定主要依據CSCs所具有的特性[9-11],即:①高致瘤性:少于104個甚至是100個腫瘤干細胞就能在免疫缺陷動物體內致瘤;②自我更新特性:腫瘤干細胞能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長并形成“sphere”;③分化潛能:在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長所得的“sphere”可被血清誘導分化,呈現貼壁生長[6];④耐藥性(drug resistance);⑤高增殖潛能。在本研究中,我們主要從腫瘤細胞的自我更新特性、分化潛能、增殖潛能三方面對分選所得的CD133陽性/陰性人肺腺癌A549細胞進行比較和鑒定。我們的研究顯示:①CD133陽性細胞組在培養(yǎng)的第9天可見“sphere”形成,隨培養(yǎng)時間遷移,數量逐漸增多,而CD133陰性細胞組培養(yǎng)至第8周未見“sphere”形成;②CD133陽性細胞組形成“sphere”置于含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)兩周全部貼壁。顯微鏡下觀察這些貼壁生長細胞的形態(tài)與未經分選的人肺腺癌A549細胞無明顯差異。誘導分化前細胞表達CD133、不表達CK7,誘導分化后CD133由陽性轉變?yōu)殛幮?,而分化標志物CK7則由陰性轉變?yōu)殛栃?。③CD133陽性、CD133陰性、未分選細胞的平均克隆形成率分別為57.3%、3.3%、8.7%,表明三組細胞增殖能力CD133陽性細胞>未分選細胞>CD133陰性細胞。未分選細胞的增殖能力居于二者之間可能與未分化細胞中含少量CD133陽性細胞有關。綜上所述,CD133陽性細胞與CD133陰性細胞在自我更新特性、分化潛能、增殖潛能方面具有明顯的差異。CD133陽性細胞具有自我更新能力,可被血清誘導分化,且具有更高的增殖潛能。因此,我們認為本實驗經MACS獲得的CD133陽性人肺腺癌A549細胞具有CSCs的特性。

    CSCs被認為是腫瘤轉移發(fā)生的主要原因,理論上說其在轉移相關基因的表達上應該與非腫瘤干細胞有明顯的差異。因此,本研究采用基因芯片技術對分選后未經培養(yǎng)的CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的腫瘤轉移相關基因進行檢測,篩選差異基因。我們采用了美國SuperArray公司生產的第二代功能分類基因芯片。該芯片按照功能或信號通路對基因進行了篩選和分類,避免了高通量基因芯片因數據過多而難以分析的缺點。同時,它還將檢測精度提高到了與實時定量PCR相當的水平,芯片檢測后無需再進行PCR驗證。因此,使用該芯片能高效、準確地對CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的腫瘤轉移基因進行篩選。

    在檢測的84個轉移基因中,差異基因涉及:①促進血管新生的基因(MYC、VEGFA、FGFR4、HGF、MET、CXCR4)和抑制血管生成的基因(HTATIP、TP53);②促進細胞遷移的基因(ITGB3、CTBP1、APC、HGF、CXCR4)和抑制細胞運動的基因(NF2、NME);③促進細胞外基質降解的調控因子相關基因(MYC、MMP2、ITGB3、IL1B);④調控細胞間黏附作用的基因(CDH1、CDH11);⑤機制未明的基因CD82、EWSR1。與CD133陰性細胞相比,CD133陽性細胞相關基因表達下調,由此可見,CD133陽性細胞在細胞外基質降解、形成新生血管及細胞運動方面可能并不具備比CD133陰性細胞更高的潛能。我們推測,CD133陽性細胞具有高增殖能力,可通過不斷增殖產生大量的子代細胞,這些子代細胞中大部分是CD133陰性細胞,它們高表達正向調控細胞外基質降解、血管新生、淋巴管生成相關的基因,通過合成相應的細胞因子降解細胞外基質、促使血管新生和淋巴管新生,為CD133陽性細胞發(fā)生轉移營造有利的環(huán)境。CD133陽性細胞由于低表達細胞間黏附分子,更易于從原發(fā)灶脫落形成“腫瘤芽”進而發(fā)生轉移。Zlobec等[12]的研究也發(fā)現在轉移性結直腸癌浸潤前緣發(fā)生上皮細胞間充質細胞化(epithelial-tomesenchymal transition, EMT)的腫瘤細胞以“腫瘤芽”形式侵潤性生長,而這些“腫瘤芽”高度表達CSCs標記物。

    在檢測的84個腫瘤轉移基因中,CD133陽性細胞與CD133陰性細胞在CD82基因的表達差異最為明顯。CD82,又稱KAI1,是1995年由Dong[13]發(fā)現并分離的腫瘤轉移抑制基因。研究[14,15]表明CD82能有效抑制肺癌的轉移。CD82通過與Duffy抗原趨化因子受體(duffy antigen receptor for chemokines, DARC)的相互作用使進入血液循環(huán)的CD82+腫瘤細胞與表達DARC的血管內皮細胞發(fā)生黏附從而阻斷腫瘤細胞的轉移[16];它還可能通過抑制轉移部位腫瘤細胞的生長從而發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用[17]。我們的研究結果顯示,與CD133陰性細胞相比,CD133陽性細胞中CD82的表達降低,兩者之間的差異達12倍。我們推測,CD133陽性細胞由于低表達CD82,與DARC+血管內皮細胞的相互作用較弱,易于發(fā)生轉移;到達轉移部位后受CD82抑制增殖的影響較小,更容易形成轉移瘤,因此在腫瘤轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。

    迄今為止,關于CSCs中轉移相關基因的研究及報道很少,CSCs在腫瘤轉移過程中的作用機制仍不清楚,有待進一步研究。

    猜你喜歡
    陽性細胞腺癌克隆
    克隆狼
    浙江:誕生首批體細胞克隆豬
    益肺解毒方聯(lián)合順鉑對人肺腺癌A549細胞的影響
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    大口黑鱸鰓黏液細胞的組織化學特征及5-HT免疫反應陽性細胞的分布
    HIF-1a和VEGF-A在宮頸腺癌中的表達及臨床意義
    GSNO對人肺腺癌A549細胞的作用
    Galectin-7多克隆抗體的制備與鑒定
    人胎腦額葉和海馬中星形膠質細胞的發(fā)育性變化
    老年胃腺癌中FOXO3a、PTEN和E-cadherin表達的關系
    国产免费一级a男人的天堂| 国产免费福利视频在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 久久精品国产综合久久久 | 亚洲精品自拍成人| 看非洲黑人一级黄片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 免费看不卡的av| 欧美成人午夜免费资源| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一级毛片电影观看| 久久人人爽人人片av| h视频一区二区三区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 综合色丁香网| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人免费观看mmmm| 老司机影院成人| 国产色爽女视频免费观看| 免费高清在线观看日韩| 搡女人真爽免费视频火全软件| xxxhd国产人妻xxx| 国产爽快片一区二区三区| 捣出白浆h1v1| 一区二区av电影网| 国产在视频线精品| 精品视频人人做人人爽| freevideosex欧美| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久久久国产电影| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 精品少妇内射三级| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 97超碰精品成人国产| 岛国毛片在线播放| 免费观看在线日韩| 免费观看a级毛片全部| 亚洲av.av天堂| 两个人看的免费小视频| 亚洲天堂av无毛| 男女免费视频国产| freevideosex欧美| 国产成人免费观看mmmm| 男女高潮啪啪啪动态图| 好男人视频免费观看在线| 我要看黄色一级片免费的| 国产成人aa在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩成人伦理影院| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| av.在线天堂| 波多野结衣一区麻豆| 美女国产视频在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美日韩av久久| 国产精品久久久久久久久免| 三上悠亚av全集在线观看| 天天影视国产精品| 国产伦理片在线播放av一区| 黄色一级大片看看| 99视频精品全部免费 在线| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av天堂久久9| 大片免费播放器 马上看| av女优亚洲男人天堂| 亚洲五月色婷婷综合| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av在线app专区| 久久这里有精品视频免费| 岛国毛片在线播放| 永久免费av网站大全| 超色免费av| 七月丁香在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜91福利影院| 亚洲av免费高清在线观看| 在线观看www视频免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩电影二区| 亚洲在久久综合| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一本色道久久久久久精品综合| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 女性生殖器流出的白浆| 永久免费av网站大全| 超色免费av| 日日撸夜夜添| 综合色丁香网| 熟女av电影| 久久久久精品人妻al黑| av.在线天堂| 男女啪啪激烈高潮av片| 一区二区av电影网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 免费观看无遮挡的男女| 老司机影院成人| 国产精品蜜桃在线观看| 国产乱来视频区| 另类精品久久| 国产在视频线精品| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 成人综合一区亚洲| 在线天堂中文资源库| 国产成人精品久久久久久| av免费观看日本| 一级毛片电影观看| 一级毛片我不卡| 青春草国产在线视频| 丝袜喷水一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲性久久影院| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日韩精品有码人妻一区| 精品一区在线观看国产| 一本久久精品| 欧美 日韩 精品 国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 搡老乐熟女国产| 亚洲成人手机| 女性被躁到高潮视频| 久久精品国产亚洲av天美| 久久狼人影院| 久久精品人人爽人人爽视色| 22中文网久久字幕| 草草在线视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 丝袜在线中文字幕| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| av女优亚洲男人天堂| av在线app专区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品福利永久在线观看| 最新中文字幕久久久久| 中国国产av一级| 成人无遮挡网站| 久久久精品区二区三区| 久久婷婷青草| 日本免费在线观看一区| 一区二区av电影网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 女性被躁到高潮视频| 成年av动漫网址| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 黑人高潮一二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 精品一区二区三卡| 秋霞伦理黄片| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 亚洲四区av| 亚洲图色成人| 十八禁网站网址无遮挡| a级毛片在线看网站| 色吧在线观看| av卡一久久| 亚洲成人一二三区av| 国产精品国产av在线观看| 国产成人精品无人区| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人免费无遮挡视频| 韩国高清视频一区二区三区| 人妻 亚洲 视频| 国产男女超爽视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 成人影院久久| 老司机影院成人| 丁香六月天网| 九草在线视频观看| 欧美精品一区二区免费开放| 丰满乱子伦码专区| 大香蕉97超碰在线| 久久国内精品自在自线图片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| a级毛片在线看网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 中文字幕亚洲精品专区| 国产午夜精品一二区理论片| 久久人妻熟女aⅴ| 国产成人免费观看mmmm| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲精品一二三| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久精品国产自在天天线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久久国产网址| 日本色播在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 最近中文字幕2019免费版| 免费观看a级毛片全部| 成人漫画全彩无遮挡| 少妇 在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品熟女少妇av免费看| 精品久久久久久电影网| av福利片在线| 亚洲,欧美,日韩| 男女下面插进去视频免费观看 | 三级国产精品片| 男人添女人高潮全过程视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 亚洲av.av天堂| 日韩免费高清中文字幕av| 国产爽快片一区二区三区| 久久久久国产网址| 午夜av观看不卡| 两个人看的免费小视频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品一二三| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品午夜福利在线看| 一本久久精品| 国产又爽黄色视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 高清av免费在线| 亚洲av免费高清在线观看| 日本欧美视频一区| 国产精品久久久久久久电影| 黑人高潮一二区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲天堂av无毛| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久99热6这里只有精品| 国产伦理片在线播放av一区| 超色免费av| 久久久久人妻精品一区果冻| 狂野欧美激情性bbbbbb| 少妇的逼水好多| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av福利一区| 国产成人aa在线观看| 考比视频在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品一区www在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 视频在线观看一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品一区www在线观看| 国产av一区二区精品久久| 国产黄色免费在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 人妻系列 视频| 亚洲国产精品999| 一区在线观看完整版| 高清不卡的av网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产av精品麻豆| av免费在线看不卡| 春色校园在线视频观看| tube8黄色片| 精品福利永久在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产乱来视频区| 日本黄色日本黄色录像| 五月伊人婷婷丁香| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产精品999| 亚洲精品一区蜜桃| 熟女人妻精品中文字幕| 丰满少妇做爰视频| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 69精品国产乱码久久久| 咕卡用的链子| 免费少妇av软件| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久人人爽人人片av| 不卡视频在线观看欧美| 视频区图区小说| 国产精品久久久久成人av| 免费少妇av软件| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久人人爽人人片av| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲av成人精品一二三区| 色视频在线一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 老司机影院毛片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产又爽黄色视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 成人免费观看视频高清| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 九草在线视频观看| 亚洲精品乱久久久久久| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 精品一区二区三卡| 在线观看免费日韩欧美大片| 免费大片18禁| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 97在线视频观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 考比视频在线观看| av免费观看日本| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 高清av免费在线| 免费看av在线观看网站| 免费高清在线观看日韩| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产乱来视频区| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇的逼好多水| 亚洲精品456在线播放app| 国产有黄有色有爽视频| 多毛熟女@视频| 飞空精品影院首页| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲情色 制服丝袜| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 乱码一卡2卡4卡精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久狼人影院| 亚洲av国产av综合av卡| 美女福利国产在线| 亚洲国产看品久久| 欧美日韩视频精品一区| 一区二区三区乱码不卡18| 久久婷婷青草| 国产精品成人在线| 久久精品国产综合久久久 | 亚洲av男天堂| 99热全是精品| 全区人妻精品视频| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲av中文av极速乱| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲国产看品久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 热re99久久国产66热| 午夜视频国产福利| 中文字幕人妻熟女乱码| 99久国产av精品国产电影| 午夜免费男女啪啪视频观看| 最黄视频免费看| 又黄又粗又硬又大视频| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| 日本wwww免费看| 9热在线视频观看99| 久久久久国产网址| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久精品人妻al黑| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲综合色惰| 亚洲人与动物交配视频| 黄色配什么色好看| 久久久久视频综合| 51国产日韩欧美| 精品酒店卫生间| 一级a做视频免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 人成视频在线观看免费观看| 午夜免费鲁丝| 少妇精品久久久久久久| 亚洲av国产av综合av卡| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 欧美激情极品国产一区二区三区 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 插逼视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日爽夜夜爽网站| h视频一区二区三区| 亚洲国产av新网站| a 毛片基地| 国产在线免费精品| 有码 亚洲区| 18禁观看日本| 大话2 男鬼变身卡| av国产精品久久久久影院| 国产精品久久久久久精品古装| 天堂中文最新版在线下载| 免费大片18禁| 免费少妇av软件| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 成人漫画全彩无遮挡| 成年av动漫网址| 制服丝袜香蕉在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品成人在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日本中文国产一区发布| 一级a做视频免费观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品一国产av| 亚洲精品国产av成人精品| 国产探花极品一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 青春草国产在线视频| 国产一区二区激情短视频 | 久久av网站| 99香蕉大伊视频| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲,欧美,日韩| 精品一区二区免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 国产熟女欧美一区二区| 人人澡人人妻人| 日韩电影二区| 日韩制服骚丝袜av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品熟女少妇av免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲第一av免费看| 视频区图区小说| 午夜激情av网站| 国产成人精品在线电影| 青春草亚洲视频在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费黄色在线免费观看| 免费观看在线日韩| 午夜福利视频精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲综合色网址| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 中国国产av一级| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲精品日本国产第一区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久精品94久久精品| av在线老鸭窝| 少妇人妻 视频| a级毛色黄片| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜91福利影院| 久久久久国产网址| 国产片内射在线| 免费人成在线观看视频色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产黄色免费在线视频| 国产片特级美女逼逼视频| 老司机影院毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产毛片在线视频| 国国产精品蜜臀av免费| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 午夜福利,免费看| 黑人猛操日本美女一级片| 美女中出高潮动态图| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧洲国产日韩| 久久久久久人人人人人| 国产 一区精品| 国产日韩欧美视频二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 热99国产精品久久久久久7| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品卡一卡二卡四卡免费| av有码第一页| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲精品美女久久av网站| 视频中文字幕在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品94久久精品| 久久婷婷青草| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩视频在线欧美| 成人国产av品久久久| 免费少妇av软件| 99久久中文字幕三级久久日本| 成年av动漫网址| 欧美bdsm另类| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产熟女午夜一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 国产黄频视频在线观看| 一级黄片播放器| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲五月色婷婷综合| 18在线观看网站| 国产乱来视频区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99热全是精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 51国产日韩欧美| 2022亚洲国产成人精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 超色免费av| 在线观看www视频免费| 香蕉国产在线看| 国产精品久久久久久久久免| 街头女战士在线观看网站| 免费看av在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 丝袜在线中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品国产av蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产一区二区在线观看av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女国产视频在线观看| 丁香六月天网| 大码成人一级视频| 久久狼人影院| 一级毛片电影观看| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久精品人妻al黑| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产成人精品在线电影| 春色校园在线视频观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产亚洲一区二区精品| 大香蕉久久成人网| 免费看av在线观看网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 高清毛片免费看| 99热网站在线观看| 国产色婷婷99| 国产高清国产精品国产三级| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久国产网址| 丝袜美足系列| 大话2 男鬼变身卡| 欧美精品亚洲一区二区| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本wwww免费看| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品欧美亚洲77777| 久久亚洲国产成人精品v| av在线播放精品| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲四区av| a级毛片在线看网站| 青春草国产在线视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲精品一区蜜桃| 久久久久视频综合| h视频一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色5月婷婷丁香| 中文字幕av电影在线播放| 插逼视频在线观看| 国产精品一区www在线观看| 久久99精品国语久久久| 欧美 日韩 精品 国产| 国产成人91sexporn| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 两个人看的免费小视频| 国产成人精品福利久久| 婷婷色综合www| 久久免费观看电影| 成人二区视频| 日日撸夜夜添|