羅布麻愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究

李瑤，黃國慶，孫堯，王雷，吳瓊（黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150090）

羅布麻愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究

李瑤，黃國慶，孫堯，王雷，吳瓊
（黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150090）

取羅布麻（Apocynum venetum L.）無菌苗中的葉、莖作為外植體，研究了不同激素組合對愈傷組織及不定芽分化的影響。結(jié)果表明：在多個激素濃度組合的培養(yǎng)基中，羅布麻的葉和莖的愈傷組織誘導(dǎo)率均能夠達(dá)到100%；但進(jìn)行不定芽分化時，莖來源的愈傷組織在不同激素配比的培養(yǎng)基中有不定芽分化，最高分化率可達(dá)到56.7%。因此，在構(gòu)建羅布麻再生體系時，選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0m g/L+NAA 0.2m g/L中、光強(qiáng)2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，并轉(zhuǎn)接到同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，最后在1/2MS培養(yǎng)基中加入適量的NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)。

羅布麻；愈傷組織；不定芽分化

羅布麻（Apocynum venetum L.），別稱紅麻、茶葉花、紅柳子等，為夾竹桃科羅布麻屬植物［1］，在我國新疆、青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、山東等省區(qū)均有分布［2-3］。羅布麻是一種抗逆性極強(qiáng)的植物，適于多種氣候和土質(zhì)，可生長于河岸、海濱鹽地、干旱內(nèi)陸地等。羅布麻的纖維價值極高，它的莖稈纖維可供紡織、造紙［4-5］。除此之外，羅布麻還有很高的藥用價值，它含有多種有效的化學(xué)成分，根、莖、花、葉均可入藥，具有降血脂、降血壓、抗炎、抗過敏等多種效用［6-7］。羅布麻是一種集鹽堿地綠化、纖維價值、藥用價值于一體的野生優(yōu)良水土保持植物，對于荒漠化的治理具有積極意義［8］。

野生狀態(tài)下的羅布麻種子繁殖成活率不高、生長遲緩、成林時間較長［9］。而且，野生羅布麻的質(zhì)量不穩(wěn)定［10］。在取材時，對其生長的土壤環(huán)境也會造成深層次的破壞［11］。目前，也曾有人工栽培的報道，但在實際操作中受到環(huán)境因素的限制，且種子繁殖技術(shù)出苗率低，生長周期長［12］。鑒于此，本研究以羅布麻幼苗的莖段、葉片作為外植體，探討愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽再生及生根誘導(dǎo)的最佳條件，為種苗的快速繁殖及進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因操作奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

吉林省采集的野生羅布麻種子，消毒后接種于MS培養(yǎng)基中，所得無菌苗的幼嫩莖段作為外植體。

1.1.2培養(yǎng)基

表1　用于羅布麻組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基Tab.1 Tissue culture m edium s fo r apocynum

羅布麻為耐鹽植物，選擇高鹽培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基作為構(gòu)建羅布麻再生體系的基本培養(yǎng)基［13］。添加生長素NAA（0.1～0.4mg/g）與細(xì)胞分裂素6-BA（0.5～2.0mg/g）配合誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽的分化，具體激素組合見表1［14-15］。采用1/2MS培養(yǎng)基并添加生長素NAA（0.1～0.4mg/g）進(jìn)行生根培養(yǎng)的誘導(dǎo)（見表2）［16-17］。

表2　生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基Tab.2 Root induction cultu re medium

1.2方法

1.2.1無菌苗的獲得

選取成熟飽滿的羅布麻種子，放于10%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5m in，用無菌水沖洗5～6次，接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶5個，置于光強(qiáng)2 500lx、光照時間16h，溫度25±3℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待無菌苗長至7cm左右時，取其莖段用于羅布麻再生體系的構(gòu)建。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)

取無菌苗的莖段及葉片，剪成一定大?。ㄇo段0.5cm左右、葉片0.04cm2左右），接種于表1中相應(yīng)的各培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。每瓶接種10個外植體，每個濃度接種3瓶共計30個，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［14］。

1.2.3不定芽的分化

待愈傷組織增殖至直徑約0.5cm時，挑取新鮮、質(zhì)地緊密的愈傷組織轉(zhuǎn)接到表1的各培養(yǎng)基中，進(jìn)一步進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。每瓶接種10個外植體，每個濃度接種3瓶共計30個，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［14］。

1.2.4不定根的誘導(dǎo)

待羅布麻分化出不定芽后，取芽叢中高約3～4cm的不定芽剪下，接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)。每瓶接種7個或8個不定芽，每個濃度4瓶共計30個，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2 500lx、光照時間12h，溫度25±3℃［18］。

1.2.5結(jié)果統(tǒng)計

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=愈傷塊數(shù)/接種個數(shù)× 100；不定芽分化率（%）=出芽愈傷塊數(shù)/愈傷個數(shù)×100；不定根誘導(dǎo)率（%）=生根個數(shù)/不定芽個數(shù)× 100。

2　結(jié)果與分析

2.1愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

MS培養(yǎng)基添加生長素NAA與細(xì)胞分裂素6-BA誘導(dǎo)愈傷組織。在激素施用的濃度范圍內(nèi)，羅布麻莖段及葉片均有愈傷組織發(fā)生。外植體接種3～4d后，葉片顏色變淡、拱起，莖段出現(xiàn)節(jié)狀增粗、失綠；7d后，顆粒狀愈傷組織從切面處長出，繼而長滿外植體表面，使莖段及葉片發(fā)生不同程度的膨大（見圖1）。羅布麻莖段在9個不同激素組合梯度培養(yǎng)基中，有6種激素組合的誘導(dǎo)率達(dá)到了100%，具體結(jié)果如表3所示。羅布麻葉片盡在編號4的激素組合下誘導(dǎo)率達(dá)到100%，具體結(jié)果見表4。由此可知，羅布麻的莖和葉均可作為外植體材料誘導(dǎo)愈傷組織，其中，使用莖段誘導(dǎo)愈傷組織效果更佳。

圖1　愈傷組織Fig.1 Callus

表3　羅布麻莖段誘導(dǎo)愈傷組織結(jié)果統(tǒng)計Tab.3 Apocynum stem callus statistical resu lts

表4　羅布麻葉片誘導(dǎo)愈傷組織結(jié)果統(tǒng)計Tab.4 Apocynum leaves callus sta tistical results

2.2不定芽分化結(jié)果

挑取愈傷組織進(jìn)行不定芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，10d后，有紅色不定芽從莖段的愈傷組織上分化，而葉片的愈傷組織則未見不定芽分化。5d后，不定芽開始形成芽叢（見圖2）。不定芽分化誘導(dǎo)的具體結(jié)果如表5所示。由此可知，莖段產(chǎn)生的愈傷組織，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中，分化率最高，可達(dá)到56.7%。

圖2　莖愈傷組織上的不定芽Fig.2 Adventitious buds from callus o fstem

2.3生根誘導(dǎo)結(jié)果

不定芽生根培養(yǎng)是在1/2MS培養(yǎng)基上加入NAA進(jìn)行誘導(dǎo)。在4個NAA供試濃度下，不定根的發(fā)生率均可達(dá)到100%。不定根健壯，長勢較好。

根據(jù)試驗結(jié)果可知，在構(gòu)建羅布麻再生體系時，可選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光強(qiáng)2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，并轉(zhuǎn)接到同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)，最后在1/2MS培養(yǎng)基中加入適量的NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)。

表5　羅布麻莖段誘導(dǎo)不定芽分化結(jié)果統(tǒng)計Tab.5 The statistical results of induced apocynum stem bud differentiation

3　結(jié)語

本試驗采用羅布麻組織培養(yǎng)中較為常用的MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同組合和配比的生長素NAA及細(xì)胞分裂素6-BA，以羅布麻無菌苗的莖段及葉片為外植體進(jìn)行羅布麻植株再生的研究。根據(jù)羅布麻愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及不定根誘導(dǎo)的試驗結(jié)果，可以得出構(gòu)建羅布麻再生體系的最佳條件，即選擇羅布麻莖段作為外植體，在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L中、光強(qiáng)2 500lx，每天光照時間12h、25±3℃的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，并轉(zhuǎn)接到同樣的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽分化的誘導(dǎo)；生根培養(yǎng)可選擇在1/2MS培養(yǎng)基中加入適量的NAA。在這一過程中，羅布麻愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)到100%，不定芽分化率可達(dá)到56.7%，不定根的誘導(dǎo)率可達(dá)到100%。由此可知，羅布麻愈傷組織誘導(dǎo)及生根誘導(dǎo)相對較容易，提高不定芽分化率是建立高效再生體系的關(guān)鍵。

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Research on Apocynum Callus Induction and Plant Regeneration

LIYao，HUANGGuo-qing，SUNYao，WANGLei，WUQiong
（InstituteofAdvanced Technology，Heilongjiang Academy ofSciences，Harbin 150090，China）

Thispaper takes the leaves，stemsofapocynum ofno vaccine asexplants to study the effectof different hormones on callus and adventitious bud differentiation.The results showed that a combination of hormone concentrations inmultiplemedia，callus induction rateofapocynum leaves and stems could reach 100%；butwhen adventitious buds，stems sources callus bud differentiation in culture has different hormone combinations，the highestdifferentiation rate reached 56.7%.Therefore，when constructing apocynum regeneration system，apocynum stem segmentswere selected asexplants，in themedium MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L，the light intensity 2500lx，day light time 12h，25 callus culture conditions±3℃and transferred to the samemedium to induce differentiation ofadventitiousbuds.In themoderate NAA addition of1/2MSm medium，itwas cultured by rooting.

Apocynum；Callus；Adventitiousbuds.

S563.7

A

1674-8646（2015）05-0015-03

2015-03-09

李瑤（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，工程師，主要從事植物基因工程研究。