連接酶-ELISA反應(yīng)檢測循環(huán)DNA基因突變研究

崔海忠，肖娜，張永平，陳大貴，唐一通△

新技術(shù)交流

連接酶-ELISA反應(yīng)檢測循環(huán)DNA基因突變研究

崔海忠1，肖娜2，張永平1，陳大貴1，唐一通2△

目的 研究一種簡便、靈敏的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型方法，使其能夠在簡單實驗條件下進行常規(guī)的臨床樣本檢測。方法 設(shè)計針對突變位點的檢測探針，通過檢測探針的連接、通用擴增、標記和ELISA反應(yīng)，根據(jù)檢測位點對應(yīng)反應(yīng)管顯色值判定突變位點的基因型。以表皮生長因子受體（EGFR）基因外顯子21和18上的3個SNP突變位點L858R、L861Q和G719C為檢測對象，對62例肺癌血漿循環(huán)DNA樣本進行檢測，并與直接測序結(jié)果進行比較。結(jié)果 通過對3個突變位點的檢測，2種方法均在L858R位點檢出雜合子突變。直接測序法僅能夠明確檢出2例雜合子突變，另外1例樣本因在突變位點出現(xiàn)不明顯的套峰而無法明確判定突變類型。而新方法能夠明確檢出6例雜合子突變。結(jié)論 建立了一種基于連接酶-ELISA的簡便、靈敏的SNP突變檢測方法，適合于在簡單實驗條件下對不均一樣本進行常規(guī)突變檢測。

多態(tài)性，單核苷酸；突變；基因型；DNA連接酶類；酶聯(lián)免疫吸附測定

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被認為是疾病易感性和藥物反應(yīng)的決定因素之一，開展SNP研究對遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與合理用藥等的發(fā)展都具有重要意義。目前，SNP突變檢測方法主要有限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）［1］、DNA測序、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）［2］、實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）［3］、TaqMan PCR［4］、焦磷酸測序（Pyrosequencing）［5-6］、質(zhì) 譜 技 術(shù)（Mass Spectrometry）［7］、SNPstream技術(shù)［8］、分子燈塔技術(shù)［9］、液相芯片技術(shù)［10］等。傳統(tǒng)的DNA測序檢測靈敏度較低［11］，因此在對腫瘤組織、穿刺活檢組織或體液樣本等不均一樣本進行檢測時有較大局限性。雖然質(zhì)譜、Pyrosequencing等技術(shù)檢測靈敏度較高，但其對實驗條件、儀器設(shè)備、試劑等具有很高的要求，在簡單實驗條件下的常規(guī)臨床檢測中難以廣泛應(yīng)用。筆者通過對構(gòu)建質(zhì)粒模板的檢測，建立了一種新的SNP檢測方法，其靈敏度可達5%［12］。本文進一步通過對非小細胞肺癌循環(huán)DNA的檢測，研究一種基于連接酶-ELISA的簡便、靈敏的SNP突變檢測方法，使其適合于在簡單實驗條件下對不均一樣本進行常規(guī)臨床檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 寡核苷酸探針：表皮生長因子受體（EGFR）基因外顯子21和18上的3個突變位點L858R、L861Q、G719C的檢測探針序列，見表1。對檢測探針進行通用引物擴增的Tag1序列和Tag2的互補序列（CTag2）分別為Tag1：5′biotin-GGGTTCGTGGTAGAGCGTCGGAGT-3′；CTag2：5′digoxin-CCAGACGACACCGAGATAGCAGCC-3′。Tag1和CTag2序列5′端分別為生物素（biotin）和地高辛（digoxin）分子修飾。所有核酸序列均由上海生工生物有限公司合成。

樣本來源：收集湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院及棗陽臨床學(xué)院2013年6月—2014年8月確診的非小細胞肺癌患者血漿樣本62例（36例腺癌，26例鱗癌）。其中男37例，女25例。

實驗試劑：低分子質(zhì)量DNA Marker-A購自生工生物工程（上海）有限公司；2×PCR Mastermix購自天根生化科技北京有限公司；鏈親和素磁珠、磁性分離器購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司；Taq DNA ligase購自New England BioLabs；QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）購自上海葉舟生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 EGFR基因擴增 用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提血漿樣本循環(huán)DNA。對外顯子18和21進行PCR擴增，擴增引物為：21-forward：5′-GAGCTTCTTCCCATGATGATCT-3′；21-reverse：5′-GAAAATGCTGGCTGACCTAAAG-3′；18-forward：5′-GAGGTGACCCTTGTCTCTGTGT-3′；18-reverse：5′-CCCAAACACTCAGTGAAACAAA-3′。擴增體系為：3 μL循環(huán)DNA樣本，0.5 μmol/L擴增引物，10 μL 2×Taq PCR Mastermix，去離子水補足20 μL。擴增條件為：95℃4 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，30個循環(huán)；72℃4 min。測定各樣本擴增產(chǎn)物序列。

1.2.2 突變檢測 （1）連接反應(yīng)。針對某個SNP位點，用上游的2條特異性檢測探針和下游的1條公用探針進行檢測。L858R、L861Q、G719C 3個突變位點的檢測探針同前期建立方法［12］。每組3個檢測管（標記為WT、MT和對照CT管）用來檢測1個SNP位點。WT和MT管分別加入2 μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，2 μL擴增產(chǎn)物和1 U Taq ligase，在MT管中加入0.1 pmol突變型特異性檢測探針和公用檢測探針，WT管中加入0.1 pmol野生型特異性檢測探針和公用檢測探針，去離子水補足20 μL。對照管CT中不加入模板序列，其他成分與檢測管相同。反應(yīng)條件為：94℃1 min，57℃2 min；5個循環(huán)；95℃5 min。（2）通用引物擴增。取2×PCR Mastermix 10 μL，各管連接反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，2 μmol/L通用擴增引物Tag1和CTag2，去離子水補足20 μL。95℃30 s；95℃25 s，65℃45 s，72℃20 s；20個循環(huán)，72℃1 min進行擴增反應(yīng)。（3）ELISA檢測。將擴增產(chǎn)物移入96孔板對應(yīng)孔中，鏈親和素磁性微粒進行純化，將磁性微粒保存于20 μL Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH 7.5）中。各孔中加入50 μL HRP標記抗地高辛抗體溶液（20%胎牛血清1∶1 000稀釋），恒溫搖床中室溫，70 r/min，30 min。磁性分離，200 μL清洗緩沖液（1× PBST）清洗3次，加入TMB底物緩沖液100 μL，室溫顯色5 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，設(shè)定背景波長595 nm，檢測波長450 nm，酶標儀（ELX 800 UV，BIO-TEK INSTRUMENTS，INC）測定各孔光密度（OD450）值。根據(jù)各檢測位點WT管、MT管和CT管對應(yīng)各孔顯色值（ODWT、ODMT和ODCT）判定所檢測SNP位點基因型（ODCT＜0.05時，以O(shè)DCT=0.05計算）。以O(shè)DWT/ODCT和ODMT/ODCT比值作為判斷標準：若ODWT/ODCT＞5，同時ODMT/ODCT＞5，則此檢測位點為雜合子突變；若只有ODWT/ODCT＞5，則此檢測位點為野生純合子；若只有ODMT/ ODCT＞5，則此檢測位點為突變純合子。

1.2.3 檢測流程 野生純合子SNP位點的檢測流程，見圖1。通過連接反應(yīng)，WT管中野生型檢測探針和公用探針能完成連接，而MT管中突變型檢測探針和公用探針不能連接，經(jīng)通用引物Tag1和CTag2的通用擴增和標記，通過ELISA進行分型檢測，檢測結(jié)果可通過觀察WT管和MT管對應(yīng)顯色孔顯色值來判定。結(jié)果判定方法為，若只在WT管對應(yīng)顯色孔有顯色值，則檢測位點為野生型；若WT、MT管對應(yīng)顯色孔均有顯色值，則為雜合突變型；若只在MT管對應(yīng)顯色孔有顯色值，則為純合突變型。

Tab.1 The sequences of oligonucleotide probes表1 寡核苷酸檢測探針序列

Fig.1 Schematic representation of ligation-ELISA assay圖1 連接酶-ELISA分型方法檢測流程圖

2 結(jié)果

對62例樣本L858R、L861Q和G719C 3個突變位點進行了檢測，并與直接測序結(jié)果進行了比較。2種方法未檢測到L861Q和G719C位點的突變，但均檢測到L858R位點有雜合子突變。直接測序僅可以明確檢測出8#、15#2例樣本是L858R位點雜合子突變，而23#樣本出現(xiàn)類似雜峰的突變堿基對應(yīng)峰，無法得出明確的基因型判斷；6#、11#、14#樣本因為突變堿基對應(yīng)峰無法從雜峰中分離，更加不能檢出突變基因型，見圖2。連接酶-ELISA方法共檢測出6#、8#、11#、14#、15#、23#共6例樣本是L858R雜合子突變。且6個突變型樣本對應(yīng)WT管在450 nm處的ODWT在1.58和1.82之間，MT管在450 nm 處ODMT均高于0.96，ODWT/ODCT和ODMT/ODCT均大于10，見表2。野生型樣本中（37#、42#、50#、58#樣本），各WT管在450 nm處ODWT大于1.5，MT管的450 nm處ODMT均低于0.16，ODWT/ODCT大于10，而ODMT/ODCT均小于5。另外，ODMT（雜合）/ODMT（野生）均高于5。且ODWT/ODCT及ODWT/ODMT也均高于10。因此，新建立方法有著簡便、靈敏的特點，適合于從不均一的樣本中進行突變等位基因的檢測。6例突變樣本（6#、8#、11#、14#、15#、23#）和4例野生型樣本（37#、42#、50#、58#）對應(yīng)各檢測管的顯色值見表2。

Fig.2 Results of direct sequencing for L858R in EGFR of circulating DNA samples圖2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點測序圖

Tab.2 Genotyping of the circulating DNA samples for L858R in EGFR with ELISA表2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點ELISA基因型分型檢測 （n=62，±s）

Tab.2 Genotyping of the circulating DNA samples for L858R in EGFR with ELISA表2 循環(huán)DNA樣本EGFR基因L858R位點ELISA基因型分型檢測 （n=62，±s）

檢測管6#樣8 本#中各檢測11 管#對應(yīng)顯色14 值#15# WT1.65±0.071.78±0.131.63±0.121.82±0.161.63±0.08 MT1.22±0.071.81±0.150.96±0.051.27±0.081.60±0.06 CT0.04±0.030.08±0.020.06±0.020.07±0.020.07±0.01檢測管23#樣37 本#中各檢測42 管#對應(yīng)顯色50 值#58# WT1.58±0.091.52±0.101.82±0.151.71±0.071.88±0.14 MT1.41±0.020.12±0.040.14±0.060.15±0.030.16±0.02 CT0.06±0.030.06±0.030.07±0.020.05±0.040.08±0.02

3 討論

3.1 SNP檢測技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀 近年來SNP的檢測方法被廣泛研究。但SNP檢測技術(shù)在檢測成本、靈敏度和常規(guī)性等方面仍需改進。如DNA直接測序的靈敏度僅有20%［11］，在對不均一樣本進行突變檢測時，無法將突變等位基因?qū)?yīng)峰線從背景峰中明確分離，從而造成假陰性結(jié)果。雖然焦磷酸測序、實時定量PCR等方法具有較高靈敏度，報道稱可達到5%［13］和1%［14］，但這些方法需依賴昂貴儀器或?qū)I(yè)人員的技術(shù)支持，且操作復(fù)雜，不能在常規(guī)實驗條件下進行突變檢測，限制了其在基層醫(yī)療和研究機構(gòu)的應(yīng)用。

3.2 建立方法靈敏度及應(yīng)用性分析 本研究方法具有較高檢測靈敏度，通過在檢測探針上設(shè)計通用擴增引物序列Tag1和Tag2，完成連接反應(yīng)后，進行連接探針的二次擴增，以大大增加檢測產(chǎn)物的數(shù)量，從而進一步在ELISA水平進行快速檢測，其檢測靈敏度可達5%［12］，因此適合于從不均一樣本中對突變等位基因進行檢測。通過對62例樣本的檢測，結(jié)果表明，直接測序結(jié)果僅能夠明確檢出2例，而其他3例因無法有效區(qū)分背景峰，不能明確判定。而本方法能夠根據(jù)ELISA結(jié)果從中明確判定出6例雜合子樣本，具有較高的檢測靈敏度。此外，與其他檢測方法如焦磷酸測序、熒光定量PCR、質(zhì)譜等方法相比，本方法操作簡單，不需借助昂貴的實驗儀器設(shè)備，只需普通PCR儀、酶標儀等簡單實驗條件即能完成。同時，所需檢測探針長度均小于50 bp，合成成本低，也沒有對熒光探針等昂貴試劑及高質(zhì)量檢測樣本的要求，具有較低的檢測成本和易操作性，因此更加適合于在普通簡單實驗條件下進行檢測。

3.3 建立方法特異性分析 為保證本方法具有較高的檢測特異性，在設(shè)計檢測探針時，除依靠特異性檢測探針3′端堿基與突變堿基的配對識別能力外，還在其3′端上游第3個堿基處引入1個錯配堿基以增強探針的識別能力。同時，特異性檢測探針和公用探針的H1和H2序列的Tm值與通用擴增引物Tag1和Tag2序列的Tm值相差7～8℃，以減少連接反應(yīng)和后續(xù)的擴增反應(yīng)之間的影響。

總之，本研究通過對非小細胞肺癌循環(huán)DNA樣本的檢測，建立了一種基于連接酶-ELISA的簡便、靈敏的SNP突變檢測方法。該方法操作簡便，有較高的檢測特異性和靈敏度，適合于在一般實驗條件下對不均一樣本進行常規(guī)突變檢測。但因ELISA方法的固有局限性，本方法不能對未知SNP位點進行突變檢測，且在檢測通量上也有限制，不適合于進行高通量檢測。

［1］Qiao W，Wang T，Zhang L，et al.Association study of single nucleotide polymorphisms in XRCC1 gene with the risk of gastric cancer in chinese population［J］.Int J Biol Sci，2013，9（7）:753-758.doi: 10.7150/ijbs.6783.eCollection 2013.

［2］Serrano ML，Yunis JJ.Identification of three new mutations in the RB1 gene in patients with sporadic retinoblastoma in Colombia［J］.Biomedica， 2013， 33（1）:53-61.doi: 10.1590/S0120-41572013000100007.

［3］Hung CC，Chiou MH，Huang BH，et al.Impact of genetic polymorphisms in ABCB1，CYP2B6，OPRM1，ANKK1 and DRD2 genes on methadone therapy in Han Chinese patients［J］.Pharmacogenomics，2011，12（11）:1525-1533.doi:10.2217/pgs.11.96.

［4］Farivar TN，Nezam MK，Johari P.Genotyping of hepatitis C virus isolated from hepatitis patients in Southeast of Iran by Taqman Realtime PCR［J］.J Pak Med Assoc，2011，61（6）:586-588.

［5］Kang SH，Pyo JY，Yang SW，et al.Detection of BRAF V600E mutation with thyroid tissue using pyrosequencing:comparison with PNA-clamping and real-time PCR［J］.Am J Clin Pathol，2013，139 （6）:759-764.doi:10.1309/AJCPN3ULH6YWBHPH.

［6］Liu TF，Zhang XL，Cai WZ，et al.Studies on the correlation of PON1 gene rs854572 single nucleotide polymorphism to clopidogrel resistance［J］.Med J Chin PLA，2012，37（10）:982-985.［劉滕飛，張效林，蔡文芝，等.PON1基因rs854572單核苷酸多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（10）: 982-985］.

［7］Mauger F，Gelfand DH，Gupta A，et al.High-specificity singletube multiplex genotyping using Ribo-PAP PCR，tag primers，alkali cleavage of RNA/DNA chimeras and MALDI-TOF MS［J］.Hum Mutat，2013，34（1）:266-273.doi:10.1002/humu.22227.

［8］Fei LJ，Ji LD，Zhang LN，et al.Application of SNPstream for medical genetics research［J］.Chin J Med Genet，2012，29（1）:9-12.［費麗娟，季林丹，張莉娜，等.SNPstream基因分型技術(shù)在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2012，29（1）:9-12］.doi:10.3760/cma.j.issn.1003-9406.2012.01.003.

［9］Liu XQ.Association study of the C2 and C3 and age-related macular degeneration in Chinese population by SnaPshot methods［J］.Int J Lab Med，2013，34（3）:285-287.［劉小琦.采用SNaPshot方法對中國老年黃斑變性與C2和C3基因單核苷酸多態(tài)性進行相關(guān)性研究［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（3）:285-287］.doi: 10.3969/j.issn.1673-4130.2013.03.012.

［10］Xiao F，Zhang WM，Zhang WY.Relations of epithelial-mesenchymal transition and expression of IGF-1R to the efficacy of gefitinib as second-line therapy for late-stage non-small cell lung cancer［J］.Med J Chin PLA，2011，36（6）:563-568.［肖鋒，張為民，張文穎.EMT和IGF-1R表達與吉非替尼二線治療晚期非小細胞肺癌療效的關(guān)系［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36（6）:563-568］.

［11］Gillian E，Zhu GS，Alexandros M，et al.EGFR mutation testing in lung cancer:a review of available methods and their use for analysis of tumour tissue and cytology samples［J］.J Clin Pathol，2013，66（2）:79-89.doi:10.1136/jclinpath-2012-201194.

［12］Cui HZ，Xiao N，Zhang YP，et al.A new method for detection of single nucleotide polymorphisms with ligase-ELISA［J］.J Biol，2014，31 （4）：95-98.［崔海忠，肖娜，張永平，等.基于連接酶-ELISA反應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性分型新方法［J］.生物學(xué)雜志，2014，31（4）：95-98］.doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2014.04.095.

［13］Dufort S，Richard MJ，de Fraipont F.Pyrosequencing method to detect KRAS mutation in formalin-fixed and paraffin-embedded tumor tissues［J］.Analytical Biochem，2009，391（2）:166-168.doi: 10.1016/j.ab.2009.05.027.

［14］Lang AH，Heinz D，Simone GR，et al.Optimized allele-specific real-time PCR assays for the detection of common mutations in KRAS and BRAF［J］.J Mol Diagn，2011，13（1）:23-28.doi:10.1016/ j.jmoldx.2010.11.007.

（2014-09-15收稿 2014-12-10修回）

（本文編輯 李鵬）

Study for gene mutation detection of circulating DNA with ligase-ELISA reaction

CUI Haizhong1，XIAO Na2，ZHANG Yongping1，CHEN Dagui1，TANG Yitong2△
1 Zaoyang Clinical College，Medical College of Hubei University of Arts and Science，Zaoyang 441200，China；2 Key Laboratory of Molecular Medicine，Medical College of Hubei University of Arts and Science
△Corrsponding Author E-mail：yitongtang@126.com

Objective To establish a single nucleotide polymorphisms genotyping（SNP）method for a convenient，accurate，and routine analysis of clinical samples.Methods Based on the design of oligonucleotide probe，the assay was performed through three steps:the conjunction of the detection probe，universal amplification，labeling and ELISA reaction.The genotype of each SNP was revealed by reading signals of each set of reaction tubes.This assay was applied to detect sixtytwo plasma samples of lung cancer for circulating DNA for three SNPs of EGFR，c.2573T＞G（L858R），EGFR，c.2582T＞A （L861Q），EGFR，c.2155 G＞T（G719C）.Results were compared with those obtained by direct sequencing.Results The heterozygote mutation was identified for L858R by both methods，although no mutation was detected for L861Q and G719C.Six samples were identified as heterozygotes with the new method，and only two samples were unambiguously identified as heterozygotes by the direct sequencing.Two additional samples could not be identified as heterozygotes because the peak of mutant allele was very low compared with that of wild allele.Conclusion The developed method enabled accurate identification of SNP in a convenient manner，and which is adapted to routine analysis from heterogeneous samples unambiguously.

polymorphism，single nucleotide；mutation；genotype；DNA ligases；enzyme-linked immunosorbent assay

R394-33

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.023

湖北省衛(wèi)生計生科研基金（WJ2015MB266）；襄陽市科技局項目（襄科業(yè)［2012］43號）；湖北省教育廳項目（Q20132604）；湖北省教育廳高校青年教師深入企業(yè)計劃項目（XD2014245）

1湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院棗陽臨床學(xué)院（郵編441200）；2湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)重點實驗室

崔海忠（1972），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤學(xué)方面研究

△E-mail：yitongtang@126.com