彌漫型肝細(xì)胞癌的克隆起源研究

張魯洲，王政祿，王玉亮，鄭虹?

臨床研究

彌漫型肝細(xì)胞癌的克隆起源研究

張魯洲1，王政祿2，3，王玉亮2，4，鄭虹2，3?

目的 探究彌漫型肝細(xì)胞癌（D-HCC）的腫瘤克隆起源方式及其行肝移植治療的預(yù)后。方法 選取2004 年8月—2012年11月天津市第一中心醫(yī)院肝移植治療的14例D-HCC患者，收集患者一般資料及術(shù)后無(wú)瘤生存資料。選取12個(gè)高頻肝癌微衛(wèi)星雜合性缺失（LOH）位點(diǎn)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）評(píng)估D-HCC的腫瘤克隆起源方式。結(jié)果 14例D-HCC患者中，有11例單中心克隆起源（IM），3例單中心伴多中心克隆起源（IM+MO）。術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間為4.5～37.4個(gè)月，無(wú)瘤生存中位時(shí)間為8.7個(gè)月。結(jié)論 D-HCC的腫瘤克隆起源方式以IM為主，肝移植可能是較為有效的治療手段。

癌，肝細(xì)胞；雜合子丟失；肝移植；彌漫型肝細(xì)胞癌；克隆起源

彌漫型肝細(xì)胞癌（diffuse hepatocellular carcinoma，D-HCC）是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中最罕見(jiàn)的類(lèi)型之一［1］。其發(fā)病?；谥兄囟雀斡不R床上通過(guò)影像學(xué)表現(xiàn)很難與肝硬化區(qū)分。由于D-HCC發(fā)病率較低、缺乏相對(duì)有效的治療手段，且其癌灶彌漫于全肝，故無(wú)法進(jìn)行手術(shù)切除，而單純的放化療效果并不理想，預(yù)后很差。一直以來(lái)對(duì)D-HCC的研究較多結(jié)節(jié)肝細(xì)胞癌少。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)D-HCC的研究多傾向于對(duì)該病的診斷［2-4］，而對(duì)該病中癌灶的生物學(xué)特性方面的研究罕有涉及。筆者對(duì)病肝通過(guò)肝癌微衛(wèi)星雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）探討癌組織克隆起源及D-HCC的生物學(xué)特性，為移植治療D-HCC的可行性提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年8月—2012年11月天津市第一中心醫(yī)院收治的原位肝移植治療的14例D-HCC患者資料。根據(jù)WHO對(duì)D-HCC的定義，選取了術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)腫瘤結(jié)節(jié)直徑0.1～1.5 cm，且均勻分布于全肝的病例。本研究通過(guò)了醫(yī)院倫理委員會(huì)審批?；颊呔橥狻?/p>

1.2 方法

1.2.1 臨床數(shù)據(jù)收集 （1）記錄性別、年齡、肝病背景及術(shù)前血清甲胎蛋白（AFP）水平。（2）從每個(gè)切除肝臟的4個(gè)不同位置分別獲得腫瘤組織，且每一部位相距＞5 cm。所有標(biāo)本常規(guī)方法進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋，4 μm石蠟切片，常規(guī)HE染色。由2位病理學(xué)專(zhuān)業(yè)醫(yī)生共同診斷作為最后診斷結(jié)果。

1.2.2 DNA提取和PCR 對(duì)石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行10 μm厚度、5～10張數(shù)量的切片，常規(guī)二甲苯-梯度乙醇方法脫蠟。在顯微切割顯微鏡下通過(guò)顯微切割獲得癌組織和非癌組織。提取癌及非癌組織的DNA，提取方法依照試劑盒提供的流程進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司。參考文獻(xiàn)［5-8］，選取12個(gè)微衛(wèi)星高頻LOH位點(diǎn)。根據(jù)位點(diǎn)信息由寶生物（大連）公司合成相關(guān)引物。本研究中使用12個(gè)微衛(wèi)星引物，見(jiàn)表1。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR產(chǎn)物10 μL加入2 μL上樣緩沖液［6×DNA-Loading Buffer，由寶生物（大連）公司生產(chǎn)］，放入95℃恒溫水浴鍋10 min變性，然后迅速放置在冰上10～15 min，將處理好的樣品加入到已經(jīng)制備好的8%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在100 V下電泳2 h，對(duì)凝膠進(jìn)行銀染［7］顯色后，判定LOH。PCR反應(yīng)與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行至少2次，以確認(rèn)LOH判定的準(zhǔn)確性。

Tab.1 Characters of 12 microsatellite markers表1 微衛(wèi)星引物詳情

1.2.4 LOH分析 在信息性病例中（根據(jù)2個(gè)等位基因的4條單鏈在變性聚丙烯酰胺不同的構(gòu)象，通過(guò)電泳進(jìn)行分離，如果條帶≥3為雜合子），與正常組織相比，腫瘤的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶消失或密度減少50%及以上的判定為L(zhǎng)OH。相反，如腫瘤的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶密度無(wú)減少或減少＜50%以上，則為雜合性保留。參考以往對(duì)LOH用于肝癌克隆起源的研究，其判斷標(biāo)準(zhǔn)［9］：如2個(gè)腫瘤之間不同位點(diǎn)的LOH結(jié)果≥30%不同，則認(rèn)為其多克隆起源，即多中心發(fā)生（multicentric occurrence，MO）；如2個(gè)腫瘤之間LOH結(jié)果相同或均為雜合性保留，則認(rèn)為是單克隆起源，即單中心發(fā)生（introhepatic metastasis，IM）；而＜30%不同被認(rèn)為是無(wú)法判斷克隆起源。比較每例D-HCC患者的不同部位癌組織在不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)LOH的差異，作為判斷肝細(xì)胞癌不同克隆起源的分子生物學(xué)依據(jù)。

1.2.5 隨訪 以術(shù)后3年內(nèi)D-HCC患者腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)為隨訪終點(diǎn)，收集14例患者的術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間資料，繪制患者Kaplan-Meier生存曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 患者一般特征 14例患者中男13例，女1例，年齡47～67歲，平均（54±6）歲。伴有乙肝肝硬化9例，丙肝肝硬化3例，乙、丙肝肝硬化2例。9例術(shù)前AFP水平＞20 μg/L，其中6例＞500 μg/L。

2.2 LOH的發(fā)生頻率及克隆起源類(lèi)型判定 所有D-HCC在1個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了LOH。統(tǒng)計(jì)位于 1p36.3、1p36.1、4q26、8p23、13q14.3、16q12.1、16q24.1、16q21、17p13.3、17p13.1的肝癌LOH的高頻位點(diǎn)D1S243、D1S507、D4S402、D4S406、D8S277、D8S520、D13S268、D16S419、D16S505、D16S514、D17S831、D17S938發(fā)生LOH的頻率分別為21.4% （3/14）、35.7%（5/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6%（4/14）、28.6%（4/14）、21.4%（3/14）、28.6% （4/14）、14.3%（2/14）、35.7%（5/14）、35.7%（5/14）和21.4%（3/14），有代表性的結(jié)果見(jiàn)圖1。LOH在12個(gè)位點(diǎn)的發(fā)生頻率見(jiàn)表2。本研究中，11例癌灶克隆起源為IM，3例為IM和MO同時(shí)存在，結(jié)果顯示盡管有3例患者的癌灶克隆起源為2種，但這并不影響筆者得出D-HCC中存在廣泛轉(zhuǎn)移這一結(jié)論。

Fig.1 Decision of LOH in D-HCC圖1 D-HCC雜合性缺失的判定

Tab.2 Frequency of LOH at 12 microsatellite loci in D-HCC表2 12個(gè)肝癌微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生雜合性缺失的統(tǒng)計(jì)

2.3 治療及隨訪情況 14例患者手術(shù)方式均為原位肝移植術(shù)，且術(shù)后均采用“他克莫司+塞尼哌+霉酚酸酯+甲基強(qiáng)的松龍”的免疫抑制方案。14例無(wú)瘤生存時(shí)間為4.5～37.4個(gè)月，中位時(shí)間為8.7個(gè)月，其中3例無(wú)瘤生存時(shí)間超過(guò)24個(gè)月?；颊叩腒aplan-Meier生存曲線，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Kaplan-Meier survival curves of D-HCC patients圖2 D-HCC患者的生存曲線

3 討論

3.1 D-HCC的特點(diǎn) D-HCC常伴有顯著的肝硬化，因其腫瘤大小與質(zhì)地較普通的肝硬化結(jié)節(jié)較難區(qū)分，臨床上，如影像學(xué)醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)不夠豐富，有時(shí)會(huì)將其漏診而單純?cè)\斷為肝硬化。有研究總結(jié)D-HCC的特點(diǎn)，主要為全肝彌漫結(jié)節(jié)，是D-HCC的特征性表現(xiàn)，主要特點(diǎn)為：腫瘤呈廣泛性粟粒狀、結(jié)節(jié)狀分布，早期腫瘤病灶較小，晚期多呈結(jié)節(jié)狀；結(jié)節(jié)可大小不等，但大多局限于0.1～2.0 cm，布滿(mǎn)整個(gè)肝臟；其次表現(xiàn)為肝腫大，為D-HCC的較特征性表現(xiàn)，由于此型肝癌多伴有肝硬化，因此肝臟在早期常常表現(xiàn)為輪廓飽滿(mǎn)，呈整體普遍性增大［2，10］。本組14例患者中，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)腫瘤結(jié)節(jié)直徑0.1～1.5 cm；11例患者的病肝較正常肝臟體積增大，有3例顯示肝臟體積縮小，這3例同時(shí)發(fā)現(xiàn)其肝硬化程度為重度，此時(shí)肝臟體積縮小可能與肝硬化的嚴(yán)重程度有關(guān)。

3.2 D-HCC的克隆起源 本組所有患者瘤灶均發(fā)現(xiàn)了IM，其中3例伴有MO，證實(shí)了D-HCC存在廣泛的肝內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移，這可能與D-HCC的發(fā)生機(jī)制有關(guān)，也有可能與D-HCC的疾病進(jìn)展有關(guān)。本研究顯示廣泛的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是D-HCC的最大特征，提示D-HCC的預(yù)后很差。此外，筆者發(fā)現(xiàn)部分患者的術(shù)前AFP水平較高，這一現(xiàn)象提示臨床醫(yī)師應(yīng)注意肝硬化伴血清AFP高值的患者，在影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤時(shí)，需要重點(diǎn)與D-HCC相鑒別。

3.3 D-HCC的治療 D-HCC雖較少見(jiàn)，但其預(yù)后極差，目前的治療手段主要有放、化療及支持治療。因腫瘤彌漫于整個(gè)肝臟，故無(wú)法行切除術(shù)，只能進(jìn)行姑息性治療。有研究通過(guò)手術(shù)或介入的方法治療D-HCC，但幾乎沒(méi)有令人滿(mǎn)意的效果［2，10-11］。本組患者移植術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，有3例患者的預(yù)后較好。鑒于此，筆者認(rèn)為肝移植手術(shù)可能是有效的治療手段，但由于病例相對(duì)較少，因此需要在今后的研究中進(jìn)一步論證。D-HCC目前尚無(wú)統(tǒng)一的治療手段且預(yù)后較差，因此尋求有效的治療手段對(duì)于D-HCC患者有重大意義，而探索D-HCC發(fā)生的機(jī)制，則有助于為臨床治療提供一定的理論參考依據(jù)。

目前，對(duì)于D-HCC的診斷，涉及到具體腫瘤的大小及個(gè)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)尚未明確，而在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中，常見(jiàn)的多結(jié)節(jié)肝細(xì)胞癌的診斷也沒(méi)有對(duì)腫瘤的個(gè)數(shù)在上限上做出明確標(biāo)準(zhǔn)。筆者認(rèn)為，多結(jié)節(jié)肝細(xì)胞癌和D-HCC的診斷在腫瘤數(shù)目上應(yīng)該有一個(gè)明確的分界，確定這個(gè)分界或許可以對(duì)D-HCC有更加深刻的認(rèn)識(shí)?？傊?，D-HCC由于其發(fā)病率較低，因此診斷相對(duì)困難，且缺乏有效統(tǒng)一的治療手段，預(yù)后較差，在今后的研究中需要對(duì)其發(fā)病機(jī)制、診斷與治療作更加深入的探討。

［1］Zhang MR，Wang HL.Value of ultrasound in the diagnosis of diffuse hepatocellular carcinoma［J］.Journal of Practical Medical Techniques，2014，21（6）：617-618.［張美榮，王宏亮.超聲對(duì)彌漫型肝癌的診斷價(jià)值［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2014，21（6）：617-618］.doi: 10.3969/j.issn.1008-6978.2007.02.020.

［2］Makino H，Kametaka H，Seike K，et al.A case of diffuse hepatocellular carcinoma（Vp4）treated by right hepatic trisegmentectomyandmultidisciplinary therapy regimens［J］.GanToKagaku Ryoho，2012，39 （12）:1997-1999.

［3］Kim YK，Han YM，Kim CS.Comparison of diffuse hepatocellular carcinoma andintrahepatic cholangiocarcinoma using sequentially acquiredgadolinium-enhanced and Resovist-enhanced MRI［J］.Eur J Radiol，2009，70（1）:94-100.doi:10.1016/j.ejrad.2008.01.015.

［4］Halyloelu N，?zkavukcu E，Erden A，et al.MR imaging in diffusetype hepatocellular carcinoma with synchronous portal vein thrombi ［J］.Turk J Gastroenterol，2011，22（2）:158-164.

［5］Wang B.Clonal origins of multiple and recurrent hepatocellular carcinoma by detection of micrusatellite loss of heterozygosity:Diagnosis and clinical significance［D］.ShangHai:Second Military Medical University，2009.［王斌.微衛(wèi)星雜合性缺失檢測(cè)多結(jié)節(jié)性和復(fù)發(fā)性肝細(xì)胞癌克隆起源及其臨床意義［D］.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2009］.doi：10.7666/d.y1504478.

［6］Dong H，Cong WM，Xian ZH，et al.Using loss of heterozygosity of microsatellitesto distinguish high-grade dysplastic nodule from early minute hepatocellular carcinoma［J］.Exp Mol Pathol，2011，91（2）: 578-583.doi:10.1016/j.yexmp.2011.06.003.

［7］Zhu Z，Zhu HF，Gu YJ，et al.Two closely neighboring hepatocellular carcinomas mimicking intrahepatic metastasis are confirmed as double primary tumors by the loss of heterozygosity analysis of microsatellites［J］.Chinese Medical Journal，2013，126（16）:3187-3189.doi:10.3760/cma.j.issn.0366-6999.20130656.

［8］Lu T，Hano H，Meng C，et al.Frequent loss of heterozygosity in two distinct regions，8p23.1 and 8p22，in hepatocellular carcinoma［J］.World J Gastroenterol，2007，13（7）:1090-1097.doi:10.3748/wjg.v13.i7.1090.

［9］Morimoto O，Nagano H，Sakon M，et al.Diagnosis of intrahepatic metastasis and multicentric carcinogenesis by microsatellite loss of heterozygosity in patients with multiple and recurrent hepatocellularcarcinomas［J］.J Hepatol，2003，39（2）:215-221.doi:10.1016/S0168-8278（03）00233-2.

［10］Liu JF，Long QY，Hu JX，et al.Imaging diagnosis and interventional therapy of diffuse type hepatic cellular carcinoma（A Report of 14 Cases）［J］.J Pract Radiol，2005，21（1）:68-71.［劉駿方，龍清云，胡金香，等.彌漫型肝癌的CT、DSA診斷及介入性治療（附14例報(bào)告）［J］.實(shí)用放射學(xué)雜志，2005，21（1）:68-71］.doi：10.3969/j.issn.1002-1671.2005.01.020.

［11］Cannon RM，Urbano J，Kralj I，et al.Management of diffuse hepatocellular carcinoma（≥10 Lesions）with doxorubicin-loaded DC beads is a safe and effective treatment option［J］.Onkologie，2012，35 （4）:184-188.doi:10.1159/000337402.

（2014-10-20收稿 2014-12-29修回）

（本文編輯 李鵬）

The clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma

ZHANG Luzhou1，WANG Zhenglu2，3，WANG Yuliang2，4，ZHENG Hong2，3?
1 First Central Clinical Institute of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China；2 Organ Transplant Center，Tianjin First Central Hospital；3 Key Laboratory of Organ Transplantation of Tianjin；4 Key Lab for Critical Care Medicine of the Ministry of Health
△Corresponding Author E-mail:zhenghongxy@163.com

Objective To determine the tumor clonal origin of diffuse hepatocellular carcinoma（D-HCC）and clinical outcome after liver transplantation.Methods Fourteen D-HCC patients who underwent liver transplantation in the Tianjin First Central Hospital between August 2004 to November 2012 were evaluated retrospectively.Their clinical characteristics and data of disease-free survival postoperatively were gathered.Twelve loss of heterozygosity sites（LOH）on high frequency microsatellite were selected.The tumor clonal origin of D-HCC was assessed by the means of PCR-SSCP.Results Of 14 D-HCC patients，intrahepatic metastasis（IM）occurred in 11 cases（11/14），and IM with multicentric occurrence（MO）occurred in 3 cases（3/14）.The disease-free survival time was 4.5 to 37.4 months，and the median time was 8.7 months.Conclusion The most frequent tumor clonal origin of D-HCC was IM.Liver transplantation may be the effective treatment for D-HCC.

carcinoma，hepatocellular；loss of heterozygosity；liver transplantation；diffuse hepatocellular carcinoma；clonal origin

R735.7

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.013

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2012AA021001）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（81470982）；天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（13KG103）；天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2014KZ028）

1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院（郵編300192）；2天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心；3天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張魯洲（1989），男，碩士在讀，主要從事肝腫瘤研究

?E-mail：zhenghongxy@163.com