桃核承氣湯對膿毒癥大鼠凝血-炎癥水平的調(diào)控作用研究*

★　黎永琳　　周紅　　鮑丹艷　劉云濤　李際強　　（.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院　廣州50405；.廣東省中醫(yī)院、廣東省中醫(yī)急癥研究重點實驗室　廣州500；.廣東祈福醫(yī)院　廣州5495）

桃核承氣湯對膿毒癥大鼠凝血-炎癥水平的調(diào)控作用研究*

★黎永琳1周紅2**鮑丹艷3劉云濤2李際強2（1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院廣州510405；2.廣東省中醫(yī)院、廣東省中醫(yī)急癥研究重點實驗室廣州510120；3.廣東祈福醫(yī)院廣州511495）

目的：觀察血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體（EPCR）對膿毒癥大鼠凝血相關(guān)因子血清凝血因子XIV（FXIV）活性及炎癥相關(guān)因子血清白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響以及桃核承氣湯對凝血-炎癥系統(tǒng)的調(diào)控作用。方法：將大鼠分為正常組、模型組（膿毒癥）、中藥組（造膿毒癥模型后用桃核承氣湯治療），采用二次打擊法建立膿毒癥模型，ELISA法檢測造模后休克開始及復蘇后第72h血清EPCR的表達以及FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，第120h各組IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果：膿毒癥大鼠的EPCR水平，中藥組與正常組、模型組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而凝血因子FXIV、IL-1β含量中藥組與正常組、模型組之間未見差異（P＞0.05）。膿毒癥大鼠造模后TNF-α水平，在第72h時中藥組（2.14± 0.55）和正常組（2.04±0.52）與模型組（2.75±0.83）含量有明顯差異（P＜0.05），第120h時中藥組（3.13±0.52）和正常組（2.77±0.3）低于模型組（3.56±0.56）水平（P＜0.05），且三組TNF-α含量均高于第72h時。結(jié)論：桃核承氣湯可能通過調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠EPCR水平的表達，抑制TNF-α水平，從而調(diào)控膿毒癥的炎癥反應。在膿毒癥的凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)中桃核承氣湯的調(diào)節(jié)凝血作用或弱于調(diào)節(jié)炎癥作用。

EPCR；TNF-α；凝血因子FXIV；中藥治療；二次打擊法

膿毒癥（sepsis）是感染、創(chuàng)傷和燒傷等多種臨床危重癥的嚴重合并癥。膿毒癥不僅表現(xiàn)有失控的炎癥反應，而且存在凝血、免疫、細胞增殖等活性的改變，是多系統(tǒng)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。蛋白C（PC）抗凝系統(tǒng)不僅具有抗凝活性，而且調(diào)整著機體免疫炎癥反應功能，膿毒癥中PC抗凝活性的下調(diào)促進了膿毒癥病理過程的進展。血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體（EPCR）是蛋白C抗凝系統(tǒng)主要成分之一。EPCR在膿毒癥中亦介導了活化蛋白C（APC）抗炎及細胞保護作用的發(fā)揮。因此，對促進嚴重感染性疾病的治療，應基于對治療方式有效評價和分子水平，對凝血-炎癥系統(tǒng)間潛在交互反應機制進行深入了解。本研究用桃核承氣湯治療膿毒癥大鼠，從EPCR表達、凝血因子XIV（FXIV）及炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6水平入手，揭示膿毒癥凝血和炎癥形成網(wǎng)絡(luò)并相互促進，內(nèi)皮細胞的網(wǎng)絡(luò)樞紐作用的病理生理學機制，從而為膿毒癥的中西醫(yī)結(jié)合防治提供新的切入點。

1　材料與方法

1.1動物及分組選用SPF級雄性SD大鼠90只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，體重200～220g，隨機分為正常組、模型組、桃核承氣湯中藥組3組，各組分別為30只。

1.2儀器與試劑高速冷凍離心機（上?？茖W儀器廠），標準規(guī)格酶標儀（上海將來實驗設(shè)備有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（昆山東旺精密儀器有限公司）。血清EPCR、FXIV、IL-1β（CSB-E08055r）、IL-6 （CSB-E04640r）、TNF-α（CSB-E11987r）ELISA試劑盒，美國CUSABIO公司生產(chǎn)。

1.3桃核承氣湯制備每劑中藥煎劑由桃仁12g、大黃12g、桂枝6g、芒硝6g、甘草6g組成，所有藥物由廣東省中醫(yī)藥中藥房提供。上述藥物加水100mL，頭煎20min，二煎加水100mL煎煮30min，分別濾取藥液，合并兩次藥液，在60℃恒溫條件下濃縮成每mL含生藥1g的藥液備用。水煎劑由廣東省中醫(yī)院中心實驗室臨床藥理室制備。生大黃于濃縮后期放入。

1.4模型制作與取材采用改良的“二次打擊法”復制大鼠膿毒癥模型［1］。正常組：正常飼養(yǎng)，不做手術(shù)處理，只行置管抽血備測，不行失血及液體復蘇處置。模型組：采用改良的“二次打擊法”復制膿毒癥大鼠模型，造模成功后，每隔1h腹腔注射5%葡萄糖鹽水（20mL/kg），作為支持治療，大鼠成活大于24h則可抽血待查。中藥組造模手術(shù)同模型組，于第一次“失血性休克-復蘇”打擊后開始經(jīng)胃管灌注桃核承氣湯2mL/kg（分別灌藥0.40～0.42mL），1次/8h。在24h前死亡者視為復蘇失敗，不取樣品及檢測。造模成功后，各組在造模第3天后，將剩下存活的一半大鼠，從大鼠經(jīng)腹主動脈采血1.8mL，全血標本于室溫放置2h后于1000xg離心20min，取上清檢測EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α；另一半大鼠在造模后第5天進行同樣的操作后，檢測IL-6、TNF-α。

1.5大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測采用定量夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），分別測定大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。通過用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測定每孔的光密度值（OD值），在加終止液后15min內(nèi)進行血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α檢測，繪制標準曲線，最后計算出大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6統(tǒng)計學處理統(tǒng)計檢驗采用SPSS18.0軟件進行分析，F(xiàn)XIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α水平用均數(shù)±標準差（±s）表示。FXIV、EPCR、IL-1β、IL-6、TNF-α各組間比較采用單因素方差分析，如方差不齊的，采用適當?shù)霓D(zhuǎn)換后再采用單因素方差分析檢驗。各組間兩兩比較采用LSD檢驗。兩個獨立樣本的比較符合方差齊性者來用獨立樣本t檢驗，不符合者采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較見表1。三組間凝血因子FXIV、IL-1β含量未見差異（P＞0.05），而EPCR水平互相不一致（P＜0.05），TNF-α水平在第3天時正常組與中藥組相近（P＞0.05），模型組與正常組、中藥組含量均不一致（P＜0.05）。

2.2各組血清IL-6、TNF-α在第72h、120h的水平比較見表1。在本次實驗中，我們對比了正常組、模型組、中藥組在第72h、第120h時IL-6、TNF-α水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第72h、120h，各組血清中IL-6的水平無差異（P＞0.05），但在第72h時，中藥組＞正常組＞模型組，第120h時，正常組＞中藥組＞模型組；而TNF-α的水平則不一致（P＜0.05），第120h時，各組TNF-α水平均高于第72h時。在整個實驗過程中，模型組TNF-α水平均高于正常組、中藥組。

表1　血清EPCR、FXIV、IL-1β、IL-6、TNF-α含量一覽表

3　討論

3.1EPCR或能抑制膿毒癥炎癥反應水平EPCR是蛋白C（PC，抗凝系統(tǒng)組成部分）或活化蛋白C （APC）的受體，PC或APC通過結(jié)合EPCR后，進入細胞內(nèi)，或進入細胞核內(nèi)發(fā)揮抗凝、抗炎作用。依據(jù)本次實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，EPCR、FXIV的水平在正常組大鼠與模型組大鼠之間無差異。我們通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，盡管都是在膿毒癥的模型中，膿毒癥組EPCR蛋白的水平和對照組相比，得到的結(jié)果不完全一致，有的研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥組的EPCR蛋白水平較對照組下降，有的研究［4］卻是發(fā)現(xiàn)EPCR蛋白水平較正常組代償性增加。而我們的實驗結(jié)果提示，EPCR水平中藥組高于正常組，模型組最低。對此我們發(fā)現(xiàn)，以上研究在檢測EPCR蛋白水平時存在一個檢測時間、實驗對象的差異，前者是采用膿毒癥細胞，在24h、48h時間點進行測定的，后者是采用盲腸結(jié)扎-穿孔建立的膿毒癥動物模型上，在22h時間點上進行測定。反觀我們的實驗則是在72h后進行EPCR蛋白水平的測定。針對以上情況，我們猜想：EPCR蛋白水平可能隨著機體反應時間的長短在體內(nèi)有一個波動的情況，在早期以EPCR代償性增加為主，中期則以下降為主，并逐漸恢復相對正常水平。為此，我們將可以進一步細化我們的實驗，并對膿毒癥不同時間段EPCR蛋白水平的檢測和觀察使用了桃核承氣湯干預后的EPCR蛋白水平表達的動態(tài)演變。

3.2通腑活血法能下調(diào)機體膿毒癥的炎癥反應水平中醫(yī)學認為，膿毒癥為邪毒入侵（嚴重感染）導致熱毒熾盛，毒熱入血，血熱互結(jié)，敗血阻滯，瘀血產(chǎn)生，毒瘀并存，最終致出血、休克、昏迷。通腑瀉下、活血化瘀是治療膿毒癥的重要措施。腸道是膿毒癥啟動器官，通腑瀉下法多以中藥大黃單味或以大承氣湯為主治療內(nèi)毒素所致腸源性感染。認為外邪與腸中糟粕搏結(jié)，腑氣不通，胃腸道內(nèi)G-過度繁殖，菌群比例失調(diào)，毒力劇增，是導致腸源性內(nèi)毒素血癥的主要病機。故采用通腑瀉下法可以蕩滌積滯，抑制過度發(fā)酵，解除腸道組織缺血缺氧狀態(tài)，恢復腸粘膜屏障功能，阻止腸道細菌移位，避免腸源性內(nèi)毒素的吸收［5-7］。在本次實驗中我們發(fā)現(xiàn)，中藥組的TNF-α水平比模型組的降低，而3組IL-6的水平是相近的，這提示我們桃核承氣湯有可能通過下調(diào)機體TNF-α水平的表達，以抑制膿毒癥炎癥水平，達到保護機體的作用。

3.3桃核承氣湯可能通過調(diào)節(jié)機體EPCR的表達，以抑制TNF-α的含量，來達到降低膿毒癥炎癥的反應水平本次實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，在正常組、模型組、中藥組EPCR表達水平變化的同時，TNF-α的水平也在變化。這提示我們EPCR表達水平與TNF-α水平可能相關(guān)。陳友琴等［8］的研究給了我們一個啟示，APC能顯著抑制TNF-α誘導的細胞因子（IL-1α和IL-8）分泌和黏附分子（ICAM-1，VCAM-1 and E-selction）表達，從而通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)炎癥反應。而EPCR作為APC的受體，APC通過與EPCR結(jié)合，從而發(fā)揮抑制TNF-α的作用，并通過下級的調(diào)控反應抑制膿毒癥炎癥的進程。而桃核承氣湯能夠通過調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠EPCR水平的表達，從而起到調(diào)控炎癥的作用。

3.4桃核承氣湯或存在調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠凝血功能的作用盡管本次實驗中3組大鼠凝血因子FXIV的表達沒有差異，但楊榮源等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，通腑活血法能調(diào)節(jié)膿毒癥凝血功能。這可能是因為我們本次實驗選用的反映凝血功能水平的指標不大合適。因此我們下一步的實驗可以選取不同的凝血指標，在不同時間段，使用桃核承氣湯進行干預，以驗證臨床發(fā)現(xiàn)，從而為揭示凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)反應機制提供切入點。

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R278

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廣東省科技計劃項目（2011B061200038）。

**通信作者：周紅（1960-），女，主任醫(yī)師，教授。Email：zhouhong282@126.com。

（2014-10-10）編輯：萬崇毅