環(huán)孢素A對(duì)冠心病患者T淋巴細(xì)胞CD40/CD40L表達(dá)的影響

劉歡，彭長(zhǎng)生，胡越成，李曦銘，叢洪良△

環(huán)孢素A對(duì)冠心病患者T淋巴細(xì)胞CD40/CD40L表達(dá)的影響

劉歡1，彭長(zhǎng)生1，胡越成2，李曦銘2，叢洪良2△

目的探討CD40/CD40L在冠心病發(fā)生發(fā)展中的作用，以及環(huán)孢素A（CsA）對(duì)CD40/CD40L是否具有抑制作用。方法71例冠心病或疑診為冠心病患者分為急性心肌梗死（AMI）組19例，不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）組18例，穩(wěn)定型心絞痛（SAP）組17例，正常對(duì)照（N）組17例。提取各組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CD40/CD40L表達(dá)水平，篩選出CD40/CD40L高表達(dá)組并給予不同濃度CsA（H1:0 mg/L；H2:0.01 mg/L；H3:0.1 mg/L；H4:1 mg/L）處理細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理組CD40/CD40L的表達(dá)水平。結(jié)果與N組相比，其他3組CD40表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），UAP組、AMI組較SAP組升高，UAP組與AMI組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD40L的表達(dá)在不同病變程度組間依次升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AMI組CD40/CD40L表達(dá)水平最高。不同濃度CsA處理后H1組CD40表達(dá)率高于H3組、H4組（均P＜0.05）。CD40L表達(dá)率在H1組顯著高于其他3組（均P＜0.05）。結(jié)論CD40/CD40L可能參與冠心病的發(fā)生發(fā)展，CsA可通過(guò)抑制CD40/CD40L從而延緩冠心病發(fā)展及改善預(yù)后。

冠心?。画h(huán)孢素A；抗原，CD40；CD40配體；流式細(xì)胞術(shù)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦峭{人類(lèi)健康的重要疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示，炎癥及免疫在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成、斑塊不穩(wěn)定以及破裂中起著相當(dāng)重要的作用［1］。CD40配體（CD40L）屬于腫瘤壞死因子超家族成員，它可表達(dá)于血小板［2］。當(dāng)血小板受到炎癥因子的刺激時(shí)，活化的血小板表面表達(dá)并釋放可溶性 CD40L （sCD40L），而sCD40L通過(guò)與其受體CD40的結(jié)合促進(jìn)炎癥因子表達(dá)、組織因子形成、血小板活化及血栓形成［3］。抑制炎癥反應(yīng)已成為當(dāng)今冠心病預(yù)防治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。環(huán)孢素A（CsA）最早應(yīng)用于減輕器官移植的排斥反應(yīng)。作為一種免疫抑制藥物，它可抑制蛋白激酶C（PKC）及鈣神經(jīng)素（CN），而PKC與CN是CD40L表達(dá)所需要的首要因素［4-5］。本文主要探討CD40/CD40L和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的關(guān)系以及CsA對(duì)CD40/CD40L表達(dá)的影響。

1　對(duì)象與方法

1.1試驗(yàn)對(duì)象選擇2013年3月—2014年1月天津市胸科醫(yī)院收治的冠心病或疑診為冠心病患者71例，按病史、心電圖、心肌損傷標(biāo)志物等診斷方法將其分為4組：急性心肌梗死（AMI）組19例，不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）組18例，穩(wěn)定型心絞痛（SAP）組17例，正常對(duì)照（對(duì)照組）17例。對(duì)照組定義為有胸痛癥狀但不伴有心電圖改變以及最終冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)無(wú)冠脈狹窄的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診急性心肌梗死但不處于急性期患者。（2）血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定的患者。（3）患者任一免疫激素水平超過(guò)正常值范圍、既往有免疫系統(tǒng)疾病史者。（4）患有惡性腫瘤、嚴(yán)重的肝腎疾病、遺傳性高脂血癥者。（5）近3個(gè)月曾服用免疫抑制藥物或影響免疫功能的藥物者。（6）妊娠或哺乳婦女。所有入選患者均自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)，本研究已得到天津市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。

1.2試劑與儀器1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。植物血凝素（PHA）和白細(xì)胞介素（IL）-2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？谷薈D40單克隆抗體及抗人CD40L單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3生化指標(biāo)的檢測(cè)及冠脈造影結(jié)果分析采集各組試驗(yàn)對(duì)象肘正中靜脈血30 mL（20 mL用于生化指標(biāo)檢測(cè)，10 mL采用EDTA抗凝管收集待流式篩選），利用全自動(dòng)生化分析儀分別檢測(cè)血膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、肌酐等生化指標(biāo)。同時(shí)對(duì)所有入選患者行冠狀動(dòng)脈造影檢查，其冠心病嚴(yán)重程度應(yīng)用Gensini積分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估［6］，計(jì)算出各患者的冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度總積分。

1.4單個(gè)核細(xì)胞的提取采用聚蔗糖—泛影葡胺密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。分離到的PBMCs懸液用5倍體積的生理鹽水洗滌2次，1 500 r/min室溫離心10 min，去掉大部分混雜的血小板，裂解紅細(xì)胞后待流式檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選加入2 mL Permeabilization Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。重復(fù)洗滌細(xì)胞后直接加入熒光標(biāo)記抗體（抗人CD40單克隆抗體、抗人CD40L單克隆抗體）20 μL，避光4℃孵育至少30 min，加入生理鹽水500 μL上流式分析儀。分析各組CD40/CD40L表達(dá)率，篩選出CD40/CD40L表達(dá)率最高的組別。

1.6CsA處理確定CD40/CD40L高表達(dá)組后調(diào)整該組淋巴細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL，每孔2 mL接種于12孔板。加入PHA（終濃度10 mg/L），IL-2（終濃度10 μg/L）刺激T淋巴細(xì)胞。分別加入不同濃度CsA（H1:0 mg/L；H2:0.01 mg/L；H3: 0.1 mg/L；H4:1 mg/L）處理。各濃度組復(fù)設(shè)3孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)分析各處理組的CD40/CD40L表達(dá)率。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。Gensini積分與CD40、CD40L表達(dá)量的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1生化指標(biāo)結(jié)果4組間性別構(gòu)成、伴高血壓病比例、糖尿病比例、CHO、肌酐水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；年齡、Gensini積分、LDL-C、HDL-C差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1　Comparison of clinical information between four groups of patients表1　各組患者臨床資料比較

2.2CD40/CD40L分子表達(dá)情況與對(duì)照組相比，其他 3組 CD40/CD40L的表達(dá)水平均升高（P＜0.05），AMI組CD40的表達(dá)水平與UAP組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AMI組CD40L表達(dá)水平均高于其他3組（P＜0.05），AMI組為CD40/CD40L高表達(dá)組，見(jiàn)表2、圖1。

Tab.2　The CD40/CD40L expression of PBMCs in four groups of patients表2各組患者PBMCs細(xì)胞CD40/CD40L表達(dá)情況　（%）

2.3Gensini積 分 與 CD40/CD40L表 達(dá) 的 關(guān)系Gensini積分與CD40、CD40L表達(dá)均呈正相關(guān)（r分別為0.725、0.732，均P＜0.01）。

2.4不同濃度CsA對(duì)AMI組CD40/CD40L表達(dá)的影響H1組、H2組的CD40表達(dá)率高于H3、H4組（均P＜0.05），H1與H2組、H3與H4組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD40L表達(dá)率H1組顯著高于其他3組，H2組高于H3、H4組（均P＜0.05），H3與H4組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

3　討論

慢性炎癥及免疫在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用，血液中的炎性介質(zhì)以及隨后的諸多炎性應(yīng)答可以促使冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成進(jìn)展、血栓形成以及斑塊不穩(wěn)定性、破裂［7］。許多炎癥介質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)參與冠心病的發(fā)生發(fā)展。

Tab.3　Effects of different levels of CsA on CD40/CD40L expression in patients with AMI表3不同濃度CsA對(duì)AMI組患者CD40/CD40L表達(dá)的影響　（n=19，%）

Fig.1　The CD40/CD40L expression of CD4+T cells in four groups of patients圖1　各組患者CD4+T細(xì)胞CD40/CD40L表達(dá)情況

CD40/CD40L系統(tǒng)是炎癥反應(yīng)中非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CD40蛋白屬于腫瘤壞死因子超家族，它是一種L型跨膜蛋白，主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞［8］。作為CD40的配體，CD40L（也稱(chēng)為CD154）也屬于腫瘤壞死因子超家族，它是一種Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞和血小板，當(dāng)機(jī)體內(nèi)某些炎癥因子如IL-1、IL-2被激活，通過(guò)激活血小板使活化了的血小板表達(dá)并分泌大量的CD40L［9］。CD40L與CD40相結(jié)合啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞增生遷移、脂肪細(xì)胞的脂肪因子釋放，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成及進(jìn)展［5］。CD40/CD40L系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，使粥樣斑塊的纖維帽變薄，從而導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定及破裂［10］。Zirlik等［11］發(fā)現(xiàn)sCD40L可以和巨噬細(xì)胞的整合素Mac-1相互作用從而促進(jìn)炎性細(xì)胞的黏附及遷移。上述研究提示CD40/CD40L系統(tǒng)可能參與并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展，也與本項(xiàng)研究結(jié)果相一致。但也有研究表明，斑塊的穩(wěn)定性并不依賴(lài)于淋巴細(xì)胞上的CD40L，可能與成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上CD40/CD40L相互反應(yīng)有關(guān)［12］，因此臨床上通過(guò)檢測(cè)血中淋巴細(xì)胞CD40及CD40L的水平，預(yù)測(cè)斑塊的穩(wěn)定程度，以便及時(shí)采取措施，預(yù)防臨床事件的發(fā)生這一想法還未得到確切證據(jù)，但其表達(dá)的升高可能會(huì)提示冠心病的嚴(yán)重程度。

CsA是一種免疫抑制藥物，起初用于減弱器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)［4］。CsA能夠抑制蛋白激酶C、鈣神經(jīng)素，從而阻滯CD40L基因的表達(dá)以及CD40L依賴(lài)的T細(xì)胞的功能；活化的T細(xì)胞核因子（NFAT）是鈣神經(jīng)素的酶作用物，它在CD40L的表達(dá)方面可能起重要作用，CsA可以通過(guò)抑制NF-AT來(lái)抑制CD40L的表達(dá)［13］。研究表明，線粒體滲透性轉(zhuǎn)變小孔（mPTP）在心肌發(fā)生缺血時(shí)處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生再灌注時(shí)即打開(kāi)，處于開(kāi)放狀態(tài)的mPTP可能引起再灌注損傷［14］。CsA作為mPTP阻斷劑，有可能減少再灌注損傷，從而改善冠心病患者預(yù)后［15］。但也有研究顯示CsA能夠通過(guò)阻斷c-jun氨基末端激酶（JNK）、p38途徑抑制T淋巴細(xì)胞的凋亡，改變血清膽固醇代謝及水平，加重動(dòng)脈粥樣硬化［16］。本研究提示CsA可能通過(guò)抑制CD40L的表達(dá)在一定程度上影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展，且提示CsA與CD40L表達(dá)可能存在劑量依賴(lài)關(guān)系。與其他研究不同的是，本研究提示CsA可能只通過(guò)CD40L途徑參與抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，由于本研究只對(duì)AMI患者進(jìn)行了不同濃度CsA影響共刺激分子表達(dá)的測(cè)定，可能導(dǎo)致結(jié)果的偏倚，有待進(jìn)行進(jìn)一步多樣本分析。

綜上所述，CD40/CD40L水平的升高可能對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展起到一定的作用；CsA可能對(duì)冠心病的治療起到一定的臨床作用，縮小或穩(wěn)定斑塊，延緩或阻止冠心病的發(fā)展。但由于樣本量較小，Gensini積分計(jì)算的主觀性因素等可能造成試驗(yàn)誤差，尚不能明確CsA是否可以對(duì)冠心病起到預(yù)防及治療作用，且不能得知單純抵抗CD40/ CD40L是否可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng)；應(yīng)用CsA進(jìn)行冠心病治療具有挑戰(zhàn)性，尚需更多大規(guī)模試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步探究。

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（2014-08-28收稿2014-11-03修回）

（本文編輯胡小寧）

The influence of CsA in CD40/CD40 ligand expression of T lymphocytes in patients with coronary artery disease

LIU Huan1，PENG Changsheng1，HU Yuecheng1，LI Ximing2，CONG Hongliang2△
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding Author E-mail:hongliangcong@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of CD40/CD40 ligand on the genesis and development of coronary artery disease（CAD），and the inhibitory effect of cyclosporine A（CsA）on CD40/CD40 ligand.MethodsA total of 71 patients were divided into four groups:acute myocardial infarction group（AMI，n=19），unstable angina pectoris group（UAP，n=18），stable angina pectoris group（SAP，n=17）and normal control group（N，n=17）.Flow cytometry was used to detect the expression of CD40 and CD40L in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）of four groups.The group in which CD40 and CD40L were produced at the highest level was chosen，and a series concentrations of CsA（H1:0 mg/L，H2:0.01 mg/L，H3: 0.1 mg/L，H4:1 mg/L）were used to treat the cells.Then the expressions of CD40 and CD40L were measured by flow cytometry.ResultsCompared with N group，the expression of CD40 was significant higher in other groups（P＜0.05）.The expression of CD40 was significant higher in UAP group and AMI group than that of SAP group.There was no significant difference in the expression of CD40 between UAP group and AMI group（P＞0.05）.The expression of CD40L was elevated and followed by different severity of CAD.There was significant difference in the expression of CD40L between groups（P＜0.05）. AMI group showed the highest expression of CD40 and CD40L.After being treated with CsA，the expression of CD40 was higher in H1 group than that of H3 group and H4 group（P＜0.05）.The expression of CD40L was significantly higher in H1 group than that of other three groups（P＜0.05）.ConclusionCD40 and CD40L may be involved in the development of CAD.Moreover，it might be restrained by CsA via regulation of CD40/CD40L.

coronary artery disease；cyclosporine A；antigens，CD40；CD40 ligand；flow cytometry

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.015

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（11JCYBJC13500）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科

劉歡（1988），男，碩士在讀，主要從事冠心病的診斷與治療等研究

△E-mail:hongliangcong@163.com