谷氨酰胺預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用及其對eNOS-NO通路的影響

牛瓊，王愛麗，王偉，胡營濱，劉成霞

谷氨酰胺預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用及其對eNOS-NO通路的影響

牛瓊，王愛麗，王偉，胡營濱，劉成霞△

目的探討谷氨酰胺（Gln）預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注損傷（IR）后的保護作用及其對內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）/一氧化氮（NO）信號通路的影響。方法將30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)（Sham）組、IR組、Gln組，每組10只，Gln組給予谷氨酰胺1 g/（kg·d），連續(xù)灌胃7 d。Sham組和IR組以同等劑量生理鹽水灌胃7 d。Sham組僅分離腸系膜上動脈（SMA）而根部不夾閉。IR組和Gln組均用無損傷血管夾夾閉SMA根部，30 min后放松血管夾形成再灌注損傷模型。各組大鼠均于制模后24 h采集腹主動脈血和回腸標本。應(yīng)用HE染色法觀察腸黏膜組織形態(tài)學改變，ELISA試劑盒雙抗體夾心法測定D-乳酸、內(nèi)毒素含量，硝酸還原酶法檢測血清NO的含量，比色法檢測血清eNOS、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的含量，熒光定量PCR（RT-PCR）檢測大鼠腸組織eNOS、iNOS mRNA表達水平。結(jié)果再灌注后，與Sham組相比，IR組腸黏膜絨毛上皮脫落，固有層崩解，部分絨毛頂端出血，腺體明顯受損；Gln組表現(xiàn)為腸黏膜絨毛上皮下間隙擴大，但不明顯，絨毛輕度水腫，腺體大致正常，固有層輕度水腫。IR組血清D-乳酸、內(nèi)毒素、iNOS水平及腸組織iNOS mRNA表達水平均高于Sham組和Gln組（P＜0.05）。IR組血清NO、eNOS含量及組織中eNOS的mRNA表達量均低于Sham組和Gln組（P＜0.05）。結(jié)論谷氨酰胺預(yù)處理可以減輕腸缺血再灌注后的組織形態(tài)學改變及損傷，其機制可能與抑制iNOS表達，增加eNOS表達，從而增加NO活性有關(guān)。

谷氨酰胺；腸；缺血；再灌注損傷；一氧化氮合酶；腸缺血再灌注損傷；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IR）是各種原因?qū)е陆M織器官缺血時，引起細胞代謝障礙和組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞［1］，當血供恢復(fù)時，組織及細胞損傷反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象［2］。腸道黏膜屏障是防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進入機體內(nèi)環(huán)境，并維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一道重要屏障［3］。腸IR損傷過程中，內(nèi)皮細胞和上皮細胞屏障功能被破壞，進而引起細菌發(fā)生移位，可引起全身性的免疫應(yīng)答和多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［4］。谷氨酰胺是腸上皮細胞重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在氧化應(yīng)激中對機體起到保護作用［5］。本課題組前期研究表明，谷氨酰胺對體外腸上皮細胞的IR具有保護作用［6］。本研究擬利用大鼠建立腸IR模型，探討谷氨酰胺對大鼠腸IR后的保護作用及其可能作用機制。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑谷氨酰胺粉末，純度99%，購自美國Sigma公司；綜合國內(nèi)外文獻，本實驗采用的劑量為1 g/kg。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及內(nèi)皮細胞型一氧化氮合酶（eNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，D-乳酸試劑盒購自廈門慧嘉生物有限公司，內(nèi)毒素試劑盒購于廈門鱟試劑實驗廠有限公司，HE所需相關(guān)試劑如伊紅、蘇木精和鹽酸酒精分化液等由實驗室自行配制而成。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購于TaKaRa大連寶生物有限公司；引物設(shè)計與合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2實驗動物與分組30只清潔級健康成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自山東大學實驗動物中心，批號：SOXXK（魯）20090001。抽簽法隨機分為假手術(shù)（Sham）組、缺血再灌注（IR）組、谷氨酰胺（Gln）組，每組10只。

1.3方法

1.3.1動物處理及模型的建立Gln組于造模前7 d開始給予1 g/（kg·d）谷氨酰胺連續(xù)灌胃，Sham、IR組分別于造模前給予同等劑量生理鹽水灌胃。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉。Sham組：取腹正中切口，長約3.0 cm，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈（SMA），分離SMA后不作阻斷。IR組則顯露SMA，用無創(chuàng)血管夾阻斷其系膜血管30 min，造成腸缺血模型，松夾再灌注24 h。Gln組顯露SMA余操作同IR組。操作過程中所有大鼠腹腔注入37℃生理鹽水0.5 mL/kg。以保持血流動力學穩(wěn)定。實驗結(jié)束后關(guān)腹。

1.3.2標本取材與處理IR再灌注24 h后再次麻醉剖腹，立即從腹主動脈采集血標本，行全血離心（4℃、3 000 r/min）。20 min后分裝血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。剪取距回盲部約10 cm處4.0 cm長回腸標本，迅速用冷生理鹽水溶液沖洗，清除黏液、污物等腸腔內(nèi)容物后，用濾紙吸干，立即投入裝有4%多聚甲醛溶液中固定，以備組織病理學檢測。

1.4實驗指標檢測

1.4.1光鏡HE染色切取小塊置于4%多聚甲醛溶液中固定，乙醇逐級脫水，定向包埋，連續(xù)切片（厚度5 μm）。常規(guī)梯度乙醇脫水，染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。Matic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)采集圖片。

1.4.2大鼠血清內(nèi)毒素的測定應(yīng)用ELISA試劑盒，將已知內(nèi)毒素濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將內(nèi)毒素及其抗體溫育。洗滌后加入親和素標記過的辣根過氧化物酶（HRP）后，加入底物A、B，終止反應(yīng)后于545 nm波長處讀取吸光度（A）值，建立標準曲線，測得樣品中內(nèi)毒素的濃度。

1.4.3血清中D-乳酸含量的測定采用慧嘉生物公司D-乳酸酶聯(lián)免疫分析試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾心法測定血清中大鼠D-乳酸的水平。用酶標儀在450 nm波長下測定A值，通過標準曲線計算樣品中大鼠D-乳酸的濃度。

1.4.4血清NO、eNOS、iNOS含量的測定根據(jù)說明書方法，采用硝酸還原酶法測定NO含量，比色法測定eNOS、iNOS含量。

1.4.5腸組織eNOS、iNOS mRNA表達的測定用Trizol一步法提取RNA，用微量核酸蛋白測定儀（Gene Company Limited ND2000）測定RNA的濃度和純度；逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書操作。eNOS引物上游5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3′；iNOS引物上游5′-TTGCTACAGGGTTTCATCCAG-3′，下游5′-ATGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3′。β-actin引物上游 5′-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3′，下游5′-TGCTGATCCACATCTGCTGGA-3′。按SYBR Premix Ex TaqTM的RT-PCR試劑盒說明書操作，擴增條件為：預(yù)變性95℃30 s，變性95℃5 s，退火60℃34 s，最后延伸10 min，40個循環(huán)，重復(fù)實驗3次。在熒光定量PCR分析儀上（Roter Gene 3000-澳大利亞Corbett公司）進行擴增。用2-ΔΔCt方法分析各組mRNA的差異。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1谷氨酰胺對IR后腸黏膜形態(tài)學的影響Sham組絨毛排列整齊，無水腫。腺體正常，上皮下間隙無擴大，固有層無水腫、無出血；IR組主要表現(xiàn)為腸黏膜絨毛上皮脫落，固有層崩解，部分絨毛頂端出血，腺體明顯受損；Gln組表現(xiàn)為腸黏膜絨毛上皮下間隙擴大，但不明顯，絨毛輕度水腫，腺體大致正常，固有層輕度水腫，見圖1。

2.2谷氨酰胺對腸IR后血清中內(nèi)毒素、D-乳酸水平的影響與Sham組相比，IR組和Gln組血清中內(nèi)毒素、D-乳酸含量升高；與IR組相比，Gln組內(nèi)毒素、D-乳酸含量降低（P＜0.05），見表1。

Fig.1　Comparison of HE staining of intestinal tissues between three groups（×400）圖1　各組大鼠腸組織HE染色結(jié)果比較（×400）

Tab.1　Comparison of serum endotoxin and D-lactic acid levels between three groups表1　各組大鼠血清中內(nèi)毒素及D-乳酸含量的比較（n=10，±s）

Tab.1　Comparison of serum endotoxin and D-lactic acid levels between three groups表1　各組大鼠血清中內(nèi)毒素及D-乳酸含量的比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與IR組比較，P＜0.05；表2、3同

組別Sham組IR組Gln組F內(nèi)毒素（EU/mL）0.162±0.069 0.557±0.208a0.330±0.013ab57.872＊＊D-乳酸（mg/L）0.997±0.079 3.988±0.087a1.685±0.105ab35.601＊＊

2.3谷氨酰胺對IR后NO及NOS的影響與Sham組相比，IR組血清NO、eNOS含量下降，iNOS含量升高；Gln組NO、eNOS、iNOS含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與IR組相比，Gln組血清NO、eNOS含量升高，iNOS含量下降，見表2。與Sham組相比，IR組腸組織 eNOS mRNA表達下降，iNOS mRNA表達升高；Gln組腸組織eNOS、iNOS mRNA表達升高。與 IR組相比，Gln組 eNOS mRNA表達升高，而iNOS mRNA表達下降，見表3。

Tab.2　Comparison of serum NO,eNOS and iNOS contents between three groups表2各組大鼠血清NO、eNOS、iNOS含量的比較（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of serum NO,eNOS and iNOS contents between three groups表2各組大鼠血清NO、eNOS、iNOS含量的比較（n=10，±s）

組別Sham組IR組Gln組F NO（μmol/L）43.220±2.306 30.640±2.863a42.173±3.217b60.153＊＊eNOS（U/mL）19.456±1.780 14.230±1.389a22.634±2.132b79.681＊＊iNOS（U/mL）10.930±0.983 17.154±1.143a11.622±0.821b37.170＊＊

Tab.3　Comparison of eNOS and iNOS mRNA expressions in intestinal tissues between three groups表3各組大鼠腸組織eNOS、iNOS mRNA表達水平比較（n=10，±s）

Tab.3　Comparison of eNOS and iNOS mRNA expressions in intestinal tissues between three groups表3各組大鼠腸組織eNOS、iNOS mRNA表達水平比較（n=10，±s）

組別Sham組IR組Gln組F eNOS 1.000±0.000 0.672±0.083a1.482±0.120ab27.385＊＊iNOS 1.000±0.000 2.165±0.172a1.542±0.170ab19.580＊＊

3　討論

3.1關(guān)于腸IR及其病理生理機制IR是創(chuàng)傷、嚴重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程。小腸是對IR最敏感的器官之一，在腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會引起小腸的缺血性損傷，同時，小腸是機體最大的細菌庫，缺血再灌注損傷消化道，削弱小腸的生理屏障功能，腸道黏膜屏障功能損傷的主要病理改變是腸黏膜通透性增加，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、腸內(nèi)細菌移位，引起大量炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征和MODS的發(fā)生［1，3］。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁的脂多糖成分，是炎癥反應(yīng)的主要觸發(fā)因素［7］。正常情況下，機體腸腔內(nèi)含大量細菌和內(nèi)毒素。由于腸道屏障功能完整，細菌和內(nèi)毒素難以進入血液循環(huán)，當腸道屏障功能障礙時，內(nèi)毒素可穿過腸黏膜，進入血液循環(huán)，形成內(nèi)毒素血癥。D-乳酸是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，由腸道多種細菌產(chǎn)生，當腸道發(fā)生急性缺血等損傷致腸黏膜絨毛頂端上皮脫落，細胞旁路徑增加而致腸黏膜通透性增加時，腸道中細菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過受損黏膜入血，人體內(nèi)缺乏D-乳酸脫氫酶，并且其他替代途徑代謝緩慢，因此監(jiān)測血中乳酸水平可反映腸黏膜損害程度和通透性變化［8］。

3.2關(guān)于eNOS/NO機制NO及影響NO合成的主要調(diào)節(jié)因子NOS在腸IR中的作用已被既往研究證實。NO在生理情況下由eNOS催化合成，正常情況下eNOS即有表達，然而，在病理情況下，如糖尿病和IR時，eNOS催化產(chǎn)生的NO通常被認為是具有保護作用的。而炎癥反應(yīng)會促使iNOS表達增加，進而引起其合成的NO增加，對機體產(chǎn)生不利影響［9-10］。在IR或缺氧復(fù)氧情況下，大量NO與超氧化物自由基反應(yīng)形成過氧亞硝酸鹽，過氧亞硝酸鹽的亞硝化反應(yīng)可能會增加NO的有害影響［11］。IR后內(nèi)皮功能失調(diào)和炎癥過程的激活同時存在［12］，內(nèi)皮功能失調(diào)表現(xiàn)為eNOS活性降低，其產(chǎn)生的有益的NO減少，而炎癥過程激活后，進而引起iNOS激活，使其產(chǎn)生的有害的NO增加，導(dǎo)致凈結(jié)果為NO含量增加［13］，從而對腸道產(chǎn)生毒性作用。因此，本研究擬探討谷氨酰胺預(yù)處理是否可通過調(diào)節(jié)iNOS和eNOS的表達來發(fā)揮腸缺血再灌注損傷后腸黏膜的保護作用。

本研究參照文獻［14］的方法制備大鼠腸IR模型，HE染色結(jié)果提示腸IR模型制備成功。筆者通過測定腸IR大鼠腸道細菌代謝產(chǎn)物D-乳酸及血漿內(nèi)毒素水平來了解其腸道屏障功能及腸通透性的變化。結(jié)果顯示在腸缺血再灌注狀態(tài)下，腸黏膜屏障功能障礙、腸通透性升高，并出現(xiàn)內(nèi)毒素血癥。而Gln組血漿D-乳酸、內(nèi)毒素水平較IR組顯著降低，保護腸黏膜免受損傷，降低內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。由此可見，谷氨酰胺處理可以減低IR。大鼠血清NO、eNOS、iNOS及腸組織eNOS、iNOS mRNA的表達水平結(jié)果表明，谷氨酰胺預(yù)處理可能是通過抑制iNOS表達，促進eNOS表達，進而增加NO表達釋放來發(fā)揮腸黏膜保護作用的，但Gln調(diào)節(jié)NO的確切信號通路還有待于進一步研究。

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（2014-10-08收稿2014-12-30修回）

（本文編輯李鵬）

The protective effect of glutamine pretreatment on intestinal ischemia-reperfusion injury and eNOS/NO levels in rats

NIU Qiong，WANG Aili，WANG Wei，HU Yingbin，LIU Chengxia△
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Binzhou Meidcal University，Binzhou 256603，China
△Corresponding AuthorE-mail：phdlcx@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of glutamine（Gln）pretreatment on intestinal ischemia-reperfusion （I/R）injury and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）/nitric oxide（NO）signaling pathway in rat model.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into three groups（n=10 for each group）:sham group，I/R group and Gln group.Animals were pretreated with 1 g/（kg·d）Gln by orogastric route for 7 days in Gln group，and normal saline was given to the other two groups in the same dose.Intestinal I/R was induced by 30 min occlusion of the superior mesenteric artery followed by 24 h of reperfusion. After the operation，the intestinal histopathological changes，the plasma endotoxin level，serum D-lactic acid，eNOS，inducible NOS（iNOS）activity and NO levels were detected by ultraviolet spectrophotometer.The mRNA expressions of myocardial eNOS and iNOS were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）.ResultsAfter reperfusion，in IR group，extensive epithelial sloughing and mucosal ulceration of villous tips were observed，whereas these findings did not occur in Gln group and sham group.Compared with IR group，the serum NO，eNOS levels and eNOS mRNA expression of intestinal tissue were elevated in Gln group（P＜0.01），but the plasma endotoxin level，serum D-lactic acid，serum iNOS and intestinal iNOS mRNA expression decreased in IR group（P＜0.05）.ConclusionGlutamine pretreatment has protective effects on intestinal ischemia-reperfusion injury in vivo.The mechanism may be related to the inhibition of iNOS expression and the increased expression of eNOS，thereby increasing NO activity.

glutamine；intestines；ischemia；reperfusion injury；nitric oxide synthase；intestinal ischemia-reperfusion injury；eNOS；iNOS

R364

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.008

山東省自然科學基金（ZR2010HL051）

山東省濱州市濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編256603）

牛瓊（1973），女，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事腸黏膜屏障的臨床與基礎(chǔ)研究

△E-mail：phdlcx@163.com