老年患者醫(yī)院感染的腸外致病性大腸埃希菌毒力因子檢測(cè)及SNP分析

曹陽(yáng)，劉雙慶，魏殿軍，陳薇

臨床研究

老年患者醫(yī)院感染的腸外致病性大腸埃希菌毒力因子檢測(cè)及SNP分析

曹陽(yáng)，劉雙慶，魏殿軍△，陳薇

目的了解老年患者醫(yī)院感染腸外致病性大腸埃希菌（ExPEC）30種毒力因子的檢出情況及其分子流行病學(xué)特點(diǎn)。方法收集天津地區(qū)引起老年患者醫(yī)院感染的非重復(fù)腸外致病性大腸埃希菌140株，采用多重PCR方法檢測(cè)其毒力因子基因的存在情況，比較不同標(biāo)本來(lái)源ExPEC毒力因子基因的檢出率。從檢出fimH基因的菌株中選取50株，進(jìn)行fimH基因的擴(kuò)增與測(cè)序，將全部測(cè)序結(jié)果與大腸埃希菌對(duì)照株CFT037、UTI89和參考株K-12 Gen?Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中的fimH基因序列均輸入軟件DNAMAN 6.0.3.93中尋找單核苷酸多態(tài)性（SNPs），后將53個(gè)fimH基因序列輸入軟件MEGA4，進(jìn)行基因分型和樹(shù)狀圖的構(gòu)建。分型結(jié)果結(jié)合病例回顧，綜合分析醫(yī)院內(nèi)大腸埃希菌克隆流行情況。結(jié)果ExPEC中毒力因子基因fimH、traT、fyuA、iutA和kpsMT II的檢出率較高，非尿標(biāo)本來(lái)源ExPEC的毒力因子基因kpsM II、K5、papC、papEF、papG allele II（Internal）、papA、cnf1（CNF）、sfa/focDE和rfc的檢出率均比尿標(biāo)本來(lái)源ExPEC的高。53株菌fimH基因SNPs分析顯示，在57個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)有60種SNPs。53株菌被分為25個(gè)基因型，其中有11組菌株的基因指紋圖譜分別完全一致。未發(fā)現(xiàn)不同醫(yī)院的菌株具有相同的基因型。結(jié)論老年患者醫(yī)院感染的腸外致病性大腸埃希菌攜帶多種毒力因子基因；非尿標(biāo)本來(lái)源的大腸埃希菌可能比尿液標(biāo)本來(lái)源的菌株致病性更強(qiáng)；fimH基因SNPs分型適用于醫(yī)院大腸埃希菌克隆流行的調(diào)查，值得在今后的臨床工作中推廣。

大腸桿菌；交叉感染；毒力因子類(lèi)；多態(tài)性，單核苷酸；fimH基因

引起腸道外感染的大腸埃希菌統(tǒng)稱(chēng)腸外致病性大腸埃希菌（extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC），是導(dǎo)致尿路感染、醫(yī)院獲得性肺炎、敗血癥及褥瘡傷口感染的主要致病菌之一［1］。而以上多種感染多為醫(yī)院感染，其患者以老年人為主。ExPEC中存在多種毒力因子，如黏附素、保護(hù)素、毒素等［2］，在醫(yī)院感染的致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。ExPEC也是院內(nèi)暴發(fā)克隆流行的常見(jiàn)菌株之一，而對(duì)老年患者醫(yī)院感染的不同來(lái)源標(biāo)本中ExPEC毒力因子的檢出情況，國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少，本研究采用一種新型的大腸埃希菌基因分型方法fimH單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分型對(duì)ExPEC進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，以期為臨床預(yù)防和控制老年患者的ExPEC感染提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株2010年6月—2012年6月收集天津地區(qū)3所三級(jí)甲等綜合醫(yī)院的老年醫(yī)院感染患者140例，女85例，男55例，患者年齡65～97歲，感染種類(lèi)包括醫(yī)院感染性肺炎、尿路感染、褥瘡感染和敗血癥等。收集引起其感染的非重復(fù)腸外致病性大腸埃希菌140株，其中尿標(biāo)本來(lái)源76株（尿標(biāo)本組），其他來(lái)源標(biāo)本（包括痰、分泌物和血液等）64株（非尿標(biāo)本組）。菌株采用常規(guī)生化鑒定。醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部2001年《醫(yī)院感染管理規(guī)范》。

1.2方法

1.2.1毒力因子基因的擴(kuò)增煮沸法提取細(xì)菌DNA。采用六重三步PCR方法檢測(cè)140株大腸埃希菌中的30種毒力因子。PCR體系：Premix 10.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，水10 μL，共25 μL。反應(yīng)條件為95℃12 min；94℃30 s，63℃30 s，68℃3 min，共25個(gè)循環(huán)；72℃10 min。30種大腸埃希菌毒力因子基因的名稱(chēng)、引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度及具體檢測(cè)方法見(jiàn)文獻(xiàn)［3-4］。

1.2.2fimH基因的測(cè)序與SNPs分型分析從檢出fimH基因的菌株中選取50株，以普通PCR方法擴(kuò)增fimH基因，反應(yīng)體系及條件與多重PCR相同，其中27株來(lái)自于尿標(biāo)本，23株來(lái)自其他來(lái)源標(biāo)本。將其fimH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京Invitrogen生物公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件Se?quence Scanner version 1.0拼接后，選取其中測(cè)序結(jié)果最可靠的674 bp序列（位于大腸埃希菌參考株K-12 fimH基因的119 bp～792 bp）用于SNPs分析。將50株菌的fimH基因674 bp序列與大腸埃希菌對(duì)照株CFT037、UTI89和參考株K-12 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中fimH基因674 bp序列均輸入到軟件DNAMAN 6.0.3.93中，以參考株K-12的fimH基因序列為參比序列，找出SNPs。將全部53個(gè)fimH基因的674 bp序列輸入軟件MEGA4，進(jìn)行基因分型和樹(shù)狀圖的構(gòu)建［5］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)與Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大腸埃希菌毒力因子基因檢測(cè)30個(gè)毒力因子基因中，檢測(cè)到26個(gè)毒力因子基因，未檢測(cè)到papG internal I、gafD、cdtB、bmaE。經(jīng)檢測(cè)的140株ExPEC中，毒力因子基因fimH、traT、fyuA、iutA和kpsMT II的檢出率較高，均超過(guò)50%，PAI、K5、papC、papEF、papG allele II和papA的檢出率在20%～50%，其他毒力因子基因的檢出率較低，均＜20%。非尿標(biāo)本組的大腸埃希菌毒力因子基因kpsM II、K5、papC、papEF、papG allele II（Internal）、papA、cnf1（CNF）、sfa/focDE和rfc的檢出率均比尿標(biāo)本組高，見(jiàn)表1。

Tab.1　Detection rate of virulence factor from 140 E.coli strains表1　140株大腸埃希菌毒力因子基因檢出情況例?。?）

Fig.1　Dendrogram of fimH SNP from 50 clinical isolates and the control isolates CFT073 and UT189 as well as the reference isolate K-12圖1　50株臨床菌株與對(duì)照株CFT073、UTI89和參考株K-12的FimH SNPs分型樹(shù)狀圖

2.2fimH基因SNPs分型結(jié)果分析見(jiàn)圖1。將50株臨床菌株，對(duì)照株CFT037、UTI89和參考株K-12 的fimH基因674 bp序列輸入DNAMAN軟件后，同參考株K-12進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，在57個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中有60種SNPs。其中，28.33%（17/60）的SNPs為顛換，71.67%（43/60）的SNPs為轉(zhuǎn)換；23種SNPs導(dǎo)致22種氨基酸的替換，37種 SNPs為靜默替換。71.70%（38/53）的序列含有V48A的氨基酸替換。將53個(gè)fimH序列輸入到軟件MEGA4進(jìn)行同源性分析，53株菌被分為25個(gè)基因型。其中B42、C2669、B41、B639和B457；B626、C1230、A564、B39、K12、C1357和 A2861；B3736和C636；B513、B493、B514和B547；B583和C561；B575、B3672和B460；C601、A774、C592、C2668、A745和B3744；B595、C93 和 B586；B566和 B3674；A208、A675和 A2893；CFT073和B624的基因指紋圖譜分別完全一致。經(jīng)病例回顧性分析，未發(fā)現(xiàn)不同醫(yī)院的菌株具有相同的基因型。B42、B41、B639、B457；B513、B493、B514、B547分別來(lái)自同一年度、同一科室的不同患者的中段尿標(biāo)本。C601、A774、C592、C2668、A745、B3744來(lái)自同一年度、同一科室患者的各類(lèi)型標(biāo)本，其中A745、B3744來(lái)自同一患者間隔4個(gè)月的痰標(biāo)本和中段尿標(biāo)本，且藥敏結(jié)果完全一致。B583、C561為同一患者間隔3 d的中段尿標(biāo)本和血液標(biāo)本，且藥敏結(jié)果完全一致。其他克隆流行組內(nèi)具有相同基因型的菌株分別屬于各自醫(yī)院的不同科室。

3　討論

ExPEC毒力因子的存在和毒力的大小決定了所致疾病的種類(lèi)和嚴(yán)重程度。研究其毒力因子基因有助于了解ExPEC的致病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)老年患者醫(yī)院感染的ExPEC中攜帶多種毒力因子基因，其中檢出率比較高的毒力因子fimH、traT、fyuA、iutA和kpsMT II的檢出率與國(guó)外相關(guān)報(bào)道結(jié)果相符［6］。這幾種基因編碼的產(chǎn)物分別為黏附素、保護(hù)素和鐵攝取系統(tǒng)，其中黏附素是菌株黏附宿主細(xì)胞不被清除的最主要結(jié)構(gòu)，保護(hù)素和鐵攝取系統(tǒng)是菌株能夠在宿主內(nèi)生存的關(guān)鍵因素。這些毒力因子中某些是在大腸埃希菌進(jìn)化的早期已經(jīng)存在，某些是在大腸埃希菌受到了比較強(qiáng)的環(huán)境壓力下通過(guò)較高頻率的水平轉(zhuǎn)移而獲得。毒力因子的以上特點(diǎn)為制備相應(yīng)的疫苗預(yù)防ExPEC感染指明了方向［7］。

本研究中P菌毛相關(guān)毒力因子papG allele II （Internal）、papC、papA、papEF的總體檢出率相對(duì)較高，在20%～50%，但其在痰液、血液等非尿標(biāo)本中的檢出率均比尿液來(lái)源的標(biāo)本檢出率高。原因可能是：（1）P菌毛的受體主要分布在近端腎小管，與尿路致病性大腸埃希菌引起的腎盂腎炎的關(guān)系更密切［2］。而本研究中收集的尿標(biāo)本多來(lái)自于老年性的下尿路感染，大腸埃希菌上行侵犯到腎盂者少見(jiàn)，主要黏附在膀胱上皮細(xì)胞，與1型菌毛的作用相關(guān)，P菌毛對(duì)其作用有限［8］，因此這類(lèi)尿標(biāo)本中的大腸埃希菌P菌毛檢出率較低。（2）非尿標(biāo)本大腸埃希菌可來(lái)源于腎盂。本研究中部分大腸埃希菌敗血癥患者前期有腎盂腎炎，推測(cè)其血液中的大腸埃希菌是由于感染未得到控制，進(jìn)入血流所致，實(shí)為腎盂來(lái)源，而其他部位感染的大腸埃希菌其來(lái)源尚待證實(shí)。（3）在其他組織器官上也可能存在P菌毛的高親和力受體，除P菌毛相關(guān)毒力因子外，kpsM II、K5、cnf1 （CNF）、sfa/focDE和rfc在非尿標(biāo)本中的檢出率也比尿標(biāo)本來(lái)源的高，推測(cè)由于非尿標(biāo)本來(lái)源的大腸埃希菌攜帶有更多的毒力因子，其可能比尿液標(biāo)本來(lái)源的菌株致病性更強(qiáng)，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

在過(guò)去的20多年里，多種基因分型方法應(yīng)用到大腸埃希菌的流行病學(xué)調(diào)查。其中多位點(diǎn)序列分型（MLST）和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）的穩(wěn)定性和重復(fù)性都要強(qiáng)于其他分型方法，但操作步驟繁瑣，成本高昂限制其臨床應(yīng)用。fimH基因SNPs分型是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型的大腸埃希菌分型方法，研究證明該方法對(duì)尿路致病性大腸埃希菌的分型能力與MLST相仿［9］。fimH基因是大腸埃希菌十分重要的黏附基因，是ExPEC在感染部位趨化運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵因素［10］；絕大多數(shù)的ExPEC都具有fimH基因，本研究結(jié)果也證實(shí)該種論點(diǎn)。而且有報(bào)道稱(chēng)fimH基因中存在著大量的有義突變［11］。由于毒力因子基因相對(duì)于管家基因更容易受到宿主免疫應(yīng)答所造成的壓力，因此其在短期內(nèi)就更容易發(fā)生變異，所以與MLST相比，fimH基因SNPs分型更適合醫(yī)院內(nèi)臨床菌株克隆流行的調(diào)查。

本研究中，53株菌被分為25個(gè)基因型，其中有11組克隆流行株，且不同醫(yī)院的菌株沒(méi)有發(fā)生交叉流行，多組菌株都分別來(lái)自于同一年度，同一科室患者的標(biāo)本，表明當(dāng)時(shí)這些科室中都存在著大腸埃希菌的克隆流行；有的患者間隔時(shí)間4個(gè)月后的不同標(biāo)本都培養(yǎng)出大腸埃希菌，且藥敏結(jié)果一致，SNPs分型為同一基因型，表明該株大腸埃希菌在患者體內(nèi)長(zhǎng)期定植，一旦患者免疫力低下，就會(huì)造成感染。有的患者間隔3 d的中段尿標(biāo)本和血液標(biāo)本都培養(yǎng)出大腸埃希菌，且藥敏結(jié)果一致，SNPs分型也為同一基因型，提示該患者的血液感染來(lái)源于尿路感染。由于fimH基因SNPs分型的應(yīng)用，使臨床醫(yī)生能早期發(fā)現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)大腸埃希菌的克隆流行，能提供患者（尤其是長(zhǎng)期感染的患者）感染來(lái)源的線(xiàn)索。且fimH基因SNPs分型與MLST一樣也是基于基因序列分析，所以試驗(yàn)結(jié)果易于標(biāo)準(zhǔn)化，便于實(shí)驗(yàn)室之間的交流與溝通，可用于大范圍的菌株流行病學(xué)調(diào)查，甚至進(jìn)行國(guó)際間的基因分型比較。這種方法僅需要擴(kuò)增1個(gè)基因，明顯少于MLST的7個(gè)基因，無(wú)論從操作步驟，還是試驗(yàn)成本上都大大降低。且其分型能力與MLST相仿，適用于院內(nèi)大樣本大腸埃希菌克隆分型的初篩，值得在今后的臨床工作中推廣。

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（2014-09-19收稿2014-10-20修回）

（本文編輯閆娟）

Virulence factors detection and single nucleotide polymorphism assay of extraintestinal pathogenic E.coli in elderly nosocomial infection

CAO Yang，LIU Shuangqing，WEI Dianjun△，CHEN Wei
Department of Clinical Laboratory，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China
△Corresponding Author E-mail：weidianjun01@163.com

ObjectiveTo examine the detection rate of 30 known virulence factors（VFs）of extraintestinal pathogenic Escherichia coli（ExPEC），and to investigates the epidemiology of ExPEC in elderly nosocomial infection.MethodsA to?tal of 140 ExPEC clinical isolates from elderly nosocomial patients in hospitals in Tianjin were investigated.Multiplex PCR was performed to detect the 30 virulence factors among the E.coli strains and the detection rate of virulence factors for Ex?PEC were compared between isolates from different sites of infection.Fifty E.coli strains were shown to carry fimH gene that was amplified and sequenced.These sequences were used besides3 references strains（CFT037、UTI89 and K-12）to detect SNPs of fimH gene using DNAMAN Version 6.0.3.93 these 53 fimH sequences were used for genotyping and building dendrogram by MEGA4 software.ResultsIn ExPEC，the following virulence factor genes，fimH，traT，fyuA，iutA and kpsMT II，had a higher detection rate than those of the rest.The following virulence factor genes，kpsMT II，K5，papC，papEF，papG allele II（Internal），papA，cnf1（CNF），sfa/focDE and rfc had a a higher detectionrate from non-urine origin sam?ples than those from urine origin samples.fimH SNPs analysis of the 50 clinical isolated samples and 3 references samples showed 60 SNPs at 57 polymorphic sites.The fimH SNPs analysis classified the 53 strains into 25 genotype.The genetic fin?gerprintings of 11 isolates were exactly the same.ConclusionMany kinds of virulence factors can be found in ExPEC of el?derly nosocomial infection.The ExPEC strain isolated from non-urine origin had a stronger pathogenicity than those from urine-origin specimens.fimH SNPs analysis is suitable for molecular epidemiological investigation of ExPEC in hospital.

Escherichia coli；cross infection；virulence factors；polymorphism，single nucleotide；fimH gene

R37

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.014

天津市衛(wèi)生局科技基金（2013KZ099），天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院科研基金（Y1202）

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科（郵編300211）

曹陽(yáng)（1979），男，主管技師，碩士，主要從事醫(yī)院感染的分子流行病學(xué)研究

△E-mail：weidianjun01@163.com