伊馬替尼對(duì)兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生的作用及機(jī)制研究

路雅茹，于珍，楊萬(wàn)松，崔麗，李廣平△

伊馬替尼對(duì)兔頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生的作用及機(jī)制研究

路雅茹1，于珍2，楊萬(wàn)松3，崔麗3，李廣平3△

目的探討伊馬替尼對(duì)動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的作用及機(jī)制。方法長(zhǎng)耳白兔30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C組，分別于右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷后給予0、25、50 mg/kg伊馬替尼灌胃1次/d，連續(xù)用藥14 d處死。取雙側(cè)頸動(dòng)脈行HE及免疫組化染色A組左側(cè)頸動(dòng)脈為對(duì)照組；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）-B及受體PDGFR-β mRNA水平。ELISA法檢測(cè)PDGF-BB血漿水平。結(jié)果 （1）術(shù)后新生內(nèi)膜厚度、面積、內(nèi)/中膜厚度及面積比值較對(duì)照組均增加（P＜0.05）。（2）術(shù)側(cè)組織PDGF-B mRNA水平A組高于B組及C組（2.961±0.686、1.957±0.545、1.879±0.636，F(xiàn)=8.353，P＜0.01）；PDGFR-β mRNA水平僅C組高于A組（1.236±0.356 vs 0.708±0.372，P＜0.01）。（3）各組術(shù)后血漿PDGF-BB水平均高于術(shù)前（P＜0.01），且A組＞B組＞C組（ng/L：23.464±3.542、19.504± 2.454、16.588±1.207，F(xiàn)=17.322，P＜0.05）。（4）血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA水平正相關(guān)（r=0.806，P＜0.01）。結(jié)論伊馬替尼通過(guò)抑制PDGF-B mRNA表達(dá)而抑制動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后新生內(nèi)膜過(guò)度增生。

頸動(dòng)脈損傷；血管內(nèi)膜；甲磺酸鹽類(lèi)；血小板源性生長(zhǎng)因子；受體，血小板源生長(zhǎng)因子β；伊馬替尼

支架內(nèi)再狹窄是影響經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）遠(yuǎn)期療效的主要問(wèn)題，即使應(yīng)用藥物涂層支架仍存在5%左右的再狹窄率［1］。有大量研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮受損后中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移進(jìn)入損傷部位并過(guò)度增生是再狹窄的主要病理機(jī)制［2-3］。血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-B的生物活性形式PDGF-BB通過(guò)激活其受體PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）-β的酪氨酸激酶，參與平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移［4］。PDGFR-β抑制劑甲磺酸伊馬替尼（Imatinib mesi?late）有可能通過(guò)抑制PDGF-BB/PDGFR-β途徑起到抑制PCI術(shù)后再狹窄的作用［5］。本研究擬通過(guò)兔頸動(dòng)脈球囊損傷模型，探討伊馬替尼對(duì)新生內(nèi)膜的作用及相關(guān)機(jī)制，為防治PCI術(shù)后再狹窄尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型建立大耳白兔（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，普通級(jí)）30只，3～4月齡，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，顆粒飼料常規(guī)喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。按隨機(jī)數(shù)字表法分為單純球囊損傷組（A組）、小劑量伊馬替尼組（B組）和大劑量伊馬替尼組（C組），每組10只，雌雄各半。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉；分離右側(cè)頸動(dòng)脈；鉗夾頸內(nèi)動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈近心端線拉阻斷血流，穿刺頸外動(dòng)脈插入冠脈球囊導(dǎo)管；術(shù)前行頸動(dòng)脈超聲測(cè)量頸動(dòng)脈直徑，根據(jù)血管直徑選擇1.5 mm×15 mm至2.5 mm×15 mm球囊，0.6～1.2 MPa膨脹球囊至可以推拉球囊但有一定阻力即可，自頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處至頸總動(dòng)脈起始部反復(fù)推拉球囊5次以造成頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。造模成功A組9只、B組8只、C組10只。術(shù)后A組生理鹽水5 mL灌胃1次/d，B組伊馬替尼（諾華制藥有限公司）25 μg/kg灌胃1次/d，C組伊馬替尼50 μg/kg灌胃1次/d，連續(xù)給藥14 d后處死。

1.2HE染色及免疫組化染色取術(shù)側(cè)及對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈各1.0 cm浸入10%中性福爾馬林液中固定，常規(guī)制作病理切片，行HE染色。SEM-IPS圖像分析系統(tǒng)（日本SONY公司）測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜厚度（intima thickness，IT）、中膜厚度（media thickeness，MT），計(jì)算內(nèi)/中膜厚度比（IT/MT）。測(cè)量管腔面積、內(nèi)彈力板圍繞面積和外彈力板圍繞面積；計(jì)算內(nèi)膜面積（intima area，IA）=內(nèi)彈力板圍繞面積-管腔面積，中膜面積（media area，MA）=外彈力板圍繞面積-內(nèi)彈力板圍繞面積，計(jì)算內(nèi)/中膜面積比（IA/MA）。以A組左側(cè)頸總動(dòng)脈為對(duì)照組。免疫組化染色：脫蠟切片與3%過(guò)氧化氫37℃孵育10 min。熱修復(fù)抗原。滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫2 min。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（小鼠抗兔α-SMA單克隆抗體，武漢博士德），37℃過(guò)夜。PBS液洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色（ZLI-9017，中杉金橋）。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.3PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平測(cè)定 （1）總RNA提?。豪肨rizol（Invirtrogen公司）提取頸總動(dòng)脈組織勻漿中總RNA；紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度（OD）260/OD280，當(dāng)值為1.8～2.0時(shí)RNA純度較高，計(jì)算RNA濃度（g/L）=OD260×稀釋倍數(shù)×40/1 000。（2）逆轉(zhuǎn)錄：利用 SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒（Invirtrogen公司）完成?？俁NA 5 μg加入50 μmol/L oligio（dt）1 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、DEPC水3 μL，組成10 μL Mix1，65℃水浴5 min；然后加入10×RT buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+4 μL、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）2 μL、RNaseout（40 U/μL）1 μL、SuperScripⅢRT（200 U/μL）1 μL，組成20 μL Mix2；在PCR儀中，按照50℃50 min、85℃5 min順序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，Mix2中加入1 μL核糖核酸酶H（Rnase H），37℃20 min，得到cDNA。（3）探針?lè)▽?shí)時(shí)定量PCR（Taqman-RQ-PCR）：在GenBank中查到兔組織PDGF-B、PDGFR-β及GAPDH的mRNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板5 μL、上游引物（10 μmol/L）3 μL、下游引物（10 μmol/L）3 μL、Taqman探針（10 μmol/L）1.25 μL、Universal PCR Mix 25 μL（美國(guó)ABI公司）、滅菌蒸餾水12.75 μL。在實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)ABI公司7500）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃10 s、60℃30 s、70℃45 s，40個(gè)循環(huán)。

Tab.1　Primer sequences of PDGF-B，PDGFR-β and GAPDH表1　PDGF-B、PDGFR-β及GAPDH引物序列

1.4血漿PDGF-BB水平測(cè)定術(shù)前及處死前（術(shù)后）經(jīng)左側(cè)頸靜脈取血2 mL，EDTA抗凝，3 000 r/min、15 min，離心分離血漿。ELISA法（武漢基因美）測(cè)定血漿PDGF-BB水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS 11.5處理全部數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。術(shù)前術(shù)后均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；血漿PDGF-BB水平與PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色及免疫組化染色結(jié)果對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，無(wú)增厚，內(nèi)彈力板完整。3組右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)后內(nèi)膜顯著增生。A組內(nèi)膜增生最明顯，厚度超過(guò)中膜，細(xì)胞排列紊亂；C組新生內(nèi)膜厚度顯著低于A組、B組，僅見(jiàn)極輕度內(nèi)膜增生。3組外膜均增厚，呈A組＞B組＞C組＞對(duì)照組的趨勢(shì)，A組外膜增生最明顯、有大量纖維組織增生，C組外膜增厚最輕，見(jiàn)圖1。免疫組化染色所示α-SMA表達(dá)定位于細(xì)胞漿，陽(yáng)性為棕黃色。3組新生血管內(nèi)膜及各組血管中膜均呈棕黃色α-SMA陽(yáng)性表現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

2.2血管內(nèi)、中膜厚度及面積比較與對(duì)照組比較，3組右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)后IT、MT、IT/MT、IA、MA、IA/MA均顯著增加（P＜0.05）。IT、IT/MT、IA、IA/MA之間A組＞B組＞C組（P＜0.05），A組的MA大于B組及C組（P＜0.05），B組與C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MT在A、B、C組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

Tab.2　Comparison of intima and media thickness as well as intima and media area表2　各組內(nèi)膜、中膜厚度及面積比的比較　（±s）

Tab.2　Comparison of intima and media thickness as well as intima and media area表2　各組內(nèi)膜、中膜厚度及面積比的比較?。ā纒）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與A組比較，c與B組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組A組B組C組F n9 9 8 1 0 IT（μm）2.46±0.35 120.33±19.46a84.33±10.98ab14.79±4.40abc227.122＊＊MT（μm）50.29±3.29 78.52±12.02a77.18±6.59a75.17±11.39a18.960＊＊IT/MT（%）4.9±0.6 153.8±17.4a109.7±14.8ab19.8±5.9abc346.898＊＊組別對(duì)照組A組B組C組F n9 9 8 1 0 IA（μm2）5 635±894 386 341±104 251a187 573±69 749ab64 128±11 244abc67.531＊＊MA（μm2）154 812±8 298 310 860±59 696a279 345±68 344ab267 390±52 193ab15.396＊＊IA/MA（%）3.640±0.499 123.240±19.761a68.510±24.081ab24.420±4.016abc111.191＊＊

2.3PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平術(shù)側(cè)PDGF-B mRNA表達(dá)水平比較，A組高于自身對(duì)側(cè)（P＜0.01），B組、C組與自身對(duì)側(cè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3組之間比較，A組高于B組及C組（P＜0.05），B、C組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)側(cè)PDGFR-β mRNA表達(dá)水平C組高于A組（P＜0.05），A組、B組分別與自身對(duì)側(cè)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組顯著高于自身對(duì)側(cè)（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.4血漿PDGF-BB水平血漿PDGF-BB水平每組術(shù)后均顯著高于術(shù)前（P＜0.01）；術(shù)前A、B、C組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后3組間PDGF-BB水平A組＞B組＞C組（P＜0.01），見(jiàn)表4。

2.5術(shù)后血漿PDGF-BB水平與PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性術(shù)后A、B、C組血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r分別為0.701、0.845和0.786，均P＜0.05）。全部實(shí)驗(yàn)兔（n=27）血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.806，P＜0.01）。術(shù)后血漿PDGF-BB水平與A、B、C組及全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間PDGFR-β mRNA表達(dá)水平均無(wú)相關(guān)性（r分別為0.028、-0.115、0.276和-0.379，均P＞0.05）。

Tab.3　Comparisons of mRNA levels of PDGF-B and PDGFR-β表3　3組術(shù)后PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平比較　（±s）

Tab.3　Comparisons of mRNA levels of PDGF-B and PDGFR-β表3　3組術(shù)后PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達(dá)水平比較　（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與A組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F n　9 8 1 0 PDGF-B術(shù)側(cè)2.961±0.686 1.957±0.545a1.879±0.636a8.353＊＊對(duì)側(cè)1.502±0.342 1.429±0.349 1.468±0.257 0.181 t 5.567＊＊2.272 1.823組別A組B組C組F n　9 8 1 0 PDGFR-β術(shù)側(cè)0.708±0.372 0.948±0.464 1.236±0.356a4.248＊對(duì)側(cè)0.451±0.411 0.660±0.471 0.538±0.476 0.451 t 1.172 1.539 4.015＊＊

Tab.4　Comparisons of PDGF-BB plasma level表4　3組血漿PDGF-BB水平比較　（ng/L，±s）

Tab.4　Comparisons of PDGF-BB plasma level表4　3組血漿PDGF-BB水平比較　（ng/L，±s）

＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F n9 8 1 0術(shù)前15.066±1.700 14.623±1.276 14.415±0.980 0.574術(shù)后23.464±3.542 19.504±2.454a16.588±1.207ab17.322＊＊t 7.549＊＊6.608＊＊9.530＊＊

3　討論

PDGF-B是24 ku的陽(yáng)離子糖蛋白，由成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞合成與釋放，PDGF-BB是其生物活性形式，具有化學(xué)趨化、促細(xì)胞分裂和促血管收縮作用［6-7］。PDGF-B主要與受體PDGFR-β結(jié)合，使PDGFR-β發(fā)生二聚化和自身酪氨酸殘基磷酸化，激活下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生、遷移，參與重要生理過(guò)程［8-9］。Nakagawa等［10］對(duì)支架術(shù)后患者尸檢發(fā)現(xiàn)，在支架處新生內(nèi)膜高度分化的平滑肌細(xì)胞中可檢測(cè)出PDGF-B及PDGFR-β，提示PDGF-B及PDGFR-β與PCI術(shù)后血管內(nèi)膜修復(fù)密切相關(guān)。

伊馬替尼可抑制PDGFR，從而抑制PDGF介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移、增生，起到抑制心肌纖維化、抑制肺動(dòng)脈高壓的作用［11-12］。伊馬替尼是否可以抑制支架內(nèi)再狹窄，尚不明確。Makiyama等［5］發(fā)現(xiàn)，球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈后平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生，7 d達(dá)高峰，14 d平滑肌細(xì)胞增殖停止，達(dá)到有效藥物干預(yù)時(shí)長(zhǎng)。因此，本研究也給予動(dòng)物模型用藥14 d。本研究HE染色顯示單純球囊損傷動(dòng)脈內(nèi)膜2周后，損傷的血管內(nèi)膜均顯著增生，細(xì)胞排列紊亂，而未損傷的對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑無(wú)增生，內(nèi)彈力板完整。免疫組化染色顯示新生內(nèi)膜呈抗α-SMA陽(yáng)性反應(yīng)，提示新生血管內(nèi)膜由平滑肌細(xì)胞過(guò)度增生而成。給予不同劑量伊馬替尼后，B組及C組平滑肌細(xì)胞增殖顯著受到抑制，IT、IA、IT/MT、IA/MA均下降，且與伊馬替尼呈劑量依賴(lài)性關(guān)系。

每組術(shù)側(cè)頸動(dòng)脈PDGF-B mRNA表達(dá)水平均高于自身對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈，但僅A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3組術(shù)側(cè)PDGF-B mRNA表達(dá)水平呈伊馬替尼劑量依賴(lài)性下降趨勢(shì)，提示伊馬替尼有效抑制損傷血管組織PDGF-B mRNA表達(dá)。術(shù)后C組術(shù)側(cè)血管組織PDG?FR-β mRNA表達(dá)高于自身對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈，術(shù)側(cè)3組間PDGFR-β mRNA表達(dá)水平隨伊馬替尼劑量增加呈升高趨勢(shì)，但僅C組與A組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

伊馬替尼可以抑制組織局部PDGF-B蛋白水平、降低血漿PDGF-BB水平［12-13］。本研究表明單純球囊損傷頸動(dòng)脈后血漿PDGF-BB水平顯著升高，給予不同劑量的伊馬替尼，B組及C組血漿PDGFBB水平顯著低于A組，提示伊馬替尼可以抑制動(dòng)脈內(nèi)膜損傷后血漿PDGF-BB水平升高。但無(wú)論B組還是C組術(shù)后PDGF-BB水平仍高于術(shù)前水平，如果進(jìn)一步增加劑量是否可以完全抑制PDGF-BB水平升高及動(dòng)脈內(nèi)膜的過(guò)度增生，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。血漿PDGF-BB水平與損傷段血管組織PDGF-B mRNA表達(dá)水平正相關(guān)，提示血漿PDGFBB水平可以間接反映損傷血管組織PDGF-B mRNA表達(dá)的程度。這可能是伊馬替尼抑制PDGF-B mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響血漿蛋白水平的結(jié)果。

通過(guò)研究筆者發(fā)現(xiàn)球囊損傷后新生血管內(nèi)膜過(guò)度增生，伊馬替尼通過(guò)抑制PDGF-B mRNA表達(dá)影響PDGF-BB/PDGFR-β通路，從而抑制新生內(nèi)膜的過(guò)度增生。若將PDGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路作為干預(yù)靶點(diǎn)，以伊馬替尼作為支架藥物涂層，是否可以降低PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生，尚需日后基礎(chǔ)及臨床研究進(jìn)一步闡明。

（圖1、2見(jiàn)插頁(yè)）

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（2014-04-15收稿2014-10-06修回）

（本文編輯魏杰）

Effect and mechanism of Imatinib mesilate on intimal hyperplasia of rabbit carotid artery after ballon injury

LU Yaru1，YU Zhen2，YANG Wansong3，CUI Li3，LI Guangping3△
1 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300222，China；2 Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College；3 Tianjin Key Laboratory of Ionic-Molecular Function of Cardiovascular disease，Department of Cardiology，Tianjin Institute of Cardiology，Second Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail:tjcardiol@126.com

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Imatinib mesilate（Imatinib）on intimal hyperplasia of rabbit carotid arteries after balloon injury.MethodsThirty adult Newzealand rabbits were randomly divided into three groups:group A，B and C.Their right carotid arteries were injuried then administered with 0，25 or 50 mg/kg of Imatinib dai?ly for 14 consecutive days when the rabbits were sacrificed.The carotid arteries were harvested and sectioned for HE-stain?ing and immunohistochemisty staining.Real-Time PCR was used to examine transcription levels of PDGF-B and PDGFR-β mRNA.The plasma level of PDGF-BB was assayed by ELISA.ResultsArterial intimal hyperplasia and stenosis following balloon injury were seen in three groups.Thickness and area of neointima，ratio of thickness of intima to media，ratio of area of intima to media and mRNA level of PDGF-β are all higher in group A than those in group B than those in group C（P＜0.01）.By contrast，the mRNA transcription level of PDGFR-β increased significantly in group C than that in group A （1.236±0.356 vs 0.708±0.372；t=2.91；P＜0.01）.Plasma level of PDGF-BB increased in all three groups after balloon injury than that in the baseline（P＜0.01）.The transcription level of PDGF-BB is higher in group A than that in group B and in group C（ng/L:23.464±3.542，19.504±2.454，16.588±1.207，F(xiàn)=17.322，P＜0.05）.There was no difference between group B and C.There was positive correlation between mRNA transcription level of PDGF-B and plasma level of PDGF-BB（r= 0.806，P＜0.01）.ConclusionVascular injury can cause intimal hyperplasia and increased PDGF-B mRNA transcription. Imatinib mesilate could inhibit the intimal hyperplasia through down regulating PDGF-B mRNA transcription.

carotid artery injuries；tunica intima；mesylates；platelet-derived growth factor；receptor，platelet-derived growth factor beta；Imatinib mesilate

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.012

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2013KZ079）

1天津市胸科醫(yī)院心內(nèi)科（郵編300222）；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院；3天津市心血管病離子與分子機(jī)能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心臟科，天津心臟病學(xué)研究所

路雅茹（1972），女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病發(fā)病及支架再狹窄的機(jī)制研究

△E-mail：tjcardiol@126.com