人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離條件的優(yōu)化及傳代效應(yīng)的流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

洪敬欣，李茜，2，韓俊領(lǐng)，2△

人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離條件的優(yōu)化及傳代效應(yīng)的流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

洪敬欣1，李茜1，2，韓俊領(lǐng)1，2△

目的觀察不同膠原酶消化方法對(duì)人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）分離和培養(yǎng)結(jié)果的影響，并鑒定其分化潛能；探討傳代效應(yīng)對(duì)其免疫表型的影響。方法將制備好的臍帶標(biāo)本分別加入Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅳ型膠原酶，持續(xù)消化4～18 h，篩網(wǎng)過濾，離心收集細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度4.8× 103～1×104/cm2，接種培養(yǎng)，比較不同消化法分離人臍帶沃頓膠MSC的效果。Von kossa鈣結(jié)節(jié)染色、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記鑒定人臍帶沃頓膠MSC向成骨方向分化的能力，RT-PCR鑒定其向心肌細(xì)胞分化的能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)連續(xù)傳代后MSC的免疫表型變化。結(jié)果Ⅰ型膠原酶消化法能夠從人臍帶沃頓膠獲取了數(shù)量較多、活力較高的MSC，而且細(xì)胞出現(xiàn)伸展的時(shí)間及原代培養(yǎng)時(shí)間均短于Ⅱ型膠原酶及Ⅳ型膠原酶消化法。表面標(biāo)記分析顯示：隨著傳代次數(shù)的增加，陽性標(biāo)記CD29、CD44、CD73、CD90、CD105的表達(dá)百分率沒有變化，而陰性標(biāo)記CD31、CD34和HLA-DR的表達(dá)率增加明顯。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明：來源于人臍帶沃頓膠的MSC具有體外成骨和成心肌樣細(xì)胞分化的能力。結(jié)論Ⅰ型膠原酶消化法簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞損傷小，能穩(wěn)定、高效地從人臍帶沃頓膠中分離出MSC。

臍帶；間質(zhì)干細(xì)胞；膠原酶類；傳代效應(yīng)；沃頓膠

臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間的索狀結(jié)構(gòu)，外被羊膜、內(nèi)含分化的黏液性結(jié)締組織，結(jié)締組織內(nèi)除閉鎖的卵黃囊和尿囊外，還有臍動(dòng)脈和臍靜脈［1］。臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）可來源于沃頓膠、臍血管周圍、臍血及臍靜脈血管內(nèi)皮下，人臍帶MSC在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能向脂肪和成骨細(xì)胞分化，是理想的組織工程種子細(xì)胞。目前許多實(shí)驗(yàn)室分離人臍帶MSC的方法不盡相同，主要包括膠原酶消化法、臍靜脈內(nèi)膜消化法、植塊法［2-4］，其中膠原酶消化法多以膠原酶為主。目前尚少見關(guān)于多種膠原酶消化人臍帶沃頓膠差異的報(bào)道。為進(jìn)一步驗(yàn)證哪種膠原酶更適宜消化人臍帶沃頓膠MSC，本研究比較了不同膠原酶消化方法對(duì)人臍帶沃頓膠MSC培養(yǎng)的影響，并觀察連續(xù)傳代后其免疫表型的變化，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及在細(xì)胞治療、組織工程等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，采集足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶30份。實(shí)驗(yàn)經(jīng)采集醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。臍帶采集之前產(chǎn)婦需做艾滋病病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、支原體等檢測(cè)，全部合格以確保安全后方可采集。

1.2主要儀器與試劑恒溫CO2孵箱（美國Thermo SCI?ENTIFIC）；倒置生物顯微鏡（美國 LEICA DMI3000B，日本Nikon ECLIPSE TE300）；生物顯微鏡（國產(chǎn)XSP-17C）；DMEM/F-12培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液、PBS均購自美國GIB?CO；PE標(biāo)記的CD73、APC標(biāo)記的CD34/CD44/小鼠IgG1購自美國 GIBCO；PE標(biāo)記的 CD29/CD105/小鼠 IgG1、FITC標(biāo)記的 CD31/CD90/HLA-DR、APC標(biāo)記的小鼠IgG1κ購自英國Serotec；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、2-磷酸抗壞血酸、四環(huán)素染液、5-氮胞苷均購自美國Sigma；PI、RNase A購自北京賽馳生物科技有限公司；胎牛血清（澳大利亞PAA）；Von kossa染色液（上海舜百生物科技有限公司）。

1.3人臍帶沃頓膠MSC的分離臍帶剪斷雙側(cè)結(jié)扎部分，用1×PBS反復(fù)沖洗臍帶，然后將臍帶剪成1～5 mm3大小的組織塊后放入試劑瓶，每份臍帶標(biāo)本平均分成3份，每份分別用以下3種方法進(jìn)行分離培養(yǎng)。（1）Ⅰ型膠原酶消化法：向試劑瓶?jī)?nèi)加入Ⅰ型膠原酶，持續(xù)消化4～18 h，篩網(wǎng)過濾，離心收集細(xì)胞。用DMEM/F12培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS）重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度4.8×103～1×104個(gè)/cm2，接種于6孔板內(nèi)，37℃、5%CO2恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液。（2）Ⅱ型膠原酶消化法：向試劑瓶?jī)?nèi)加入Ⅱ型膠原酶，以下操作同（1）。（3）Ⅳ膠原酶消化法：向試劑瓶?jī)?nèi)加入Ⅳ型膠原酶，以下操作同（1）。計(jì)算獲得的總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞數(shù)，待細(xì)胞貼壁后達(dá)70%～80%融合時(shí)于倒置生物顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞集落形成單位（CFU-F），計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為50個(gè)細(xì)胞以上計(jì)為1個(gè)集落。

1.4人臍帶沃頓膠MSC細(xì)胞活力分析將0.5 mL細(xì)胞懸液加入試管中。按 1∶1加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，染色2～3 min。吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。死細(xì)胞能被臺(tái)盼藍(lán)染上色，鏡下可見深藍(lán)色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。鏡下隨機(jī)讀取任意視野分別計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，按下面公式計(jì)算細(xì)胞活力：活細(xì)胞率（%）=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100。

1.5人臍帶沃頓膠MSC周期檢測(cè)將處于對(duì)數(shù)生長期的人臍帶MSC制備成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心3 min；棄去上清，PBS漂洗1次，將細(xì)胞重懸于70%乙醇（-20℃預(yù)冷）中，4℃固定1 h以上；1 500 r/min離心3 min收集固定后的細(xì)胞；PBS洗滌1次，1 500 r/min離心3 min收集細(xì)胞；將細(xì)胞重懸于含100 mg/L RNase A和1×PI的PBS中，室溫孵育30 min；將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析。

1.6人臍帶沃頓膠MSC免疫表型檢測(cè)取P4、P7、P10、P15、P20代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整每管細(xì)胞總數(shù)為1×106個(gè)。100 μL PBS重懸，加入熒光標(biāo)記抗體10 μL；4℃避光孵育30 min；1 500 r/min離心3 min后棄上清，PBS清洗1次以去除游離的熒光抗體；400 μL PBS輕輕混勻懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入FACS專用管中，進(jìn)行儀器檢測(cè)和分析。

1.7細(xì)胞的多向分化潛能及分化后鑒定

1.7.1向成骨細(xì)胞分化將P5代細(xì)胞以5×104/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 μmol/L 2-磷酸抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液），誘導(dǎo)后行Von kossa染色及四環(huán)素?zé)晒忤b定。

1.7.2向心肌樣細(xì)胞分化將P5代細(xì)胞以5×104/孔密度接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，加10 μmol/L 5-氮胞苷，24 h后立即更換為含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)8周，提取細(xì)胞的RNA，行RT-PCR檢測(cè)人心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4和NKX2.5，心肌肌漿網(wǎng)鈣ATP酶、α-肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白I、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白及GAPDH基因的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法結(jié)果用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3組比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同分離方法對(duì)人臍帶沃頓膠MSC培養(yǎng)結(jié)果的影響Ⅰ型膠原酶消化臍帶獲得的原代細(xì)胞數(shù)量多、活性高，貼壁細(xì)胞散在分布，24 h見貼壁細(xì)胞呈單層生長，伸展為短梭形、長梭形，細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活力均優(yōu)于Ⅱ型和Ⅳ型膠原酶消化法，見圖1、表1。此后實(shí)驗(yàn)中所采用細(xì)胞均由Ⅰ型膠原酶消化所得。

Fig.1　The primary human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly isolated by three different ways of digestion（×40）圖1　人臍帶沃頓膠MSC通過不同分離方法獲得的原代細(xì)胞（×40）

Tab.1　Comparison the cell number and vitality between three different ways of isolation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表1　3種方法分離人臍帶沃頓膠MSC產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率比較?。ā纒）

Tab.1　Comparison the cell number and vitality between three different ways of isolation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表1　3種方法分離人臍帶沃頓膠MSC產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活率比較　（±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，P＜0.05

n膠原酶類型Ⅰ型膠原酶（1）Ⅱ型膠原酶（2）Ⅳ型膠原酶（3）F細(xì)胞數(shù)量（×106個(gè)）5.50±1.08 2.00±0.67a3.50±0.53a48.971＊＊細(xì)胞活率（%）95.00±2.58 71.50±1.95a59.90±3.67a400.868＊＊30 30 30

2.2人臍帶沃頓膠MSC的細(xì)胞周期情況91.67%細(xì)胞處于G0/G1期，8.33%細(xì)胞處于活化增殖狀態(tài)的S+G2+M期，見圖2。

2.3人臍帶沃頓膠MSC的免疫表型特征P4、P7、P10、P15及P20代細(xì)胞高表達(dá)黏附分子受體標(biāo)記CD29、CD44，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記 CD73（SH3）、CD105 （SH2），及干細(xì)胞標(biāo)記CD90，而低表達(dá)或不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31、造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，見圖3。P15代細(xì)胞的陰性表面標(biāo)記HLA-DR表達(dá)率增加4倍，P20代細(xì)胞的陰性表面標(biāo)記CD31、CD34和HLA-DR的表達(dá)率明顯增高，見表2。

Fig.2　Cell cycle analysis of human umbilical cord mesenchymalstromal cells in Wharton's jelly圖2　人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期分析

Fig.3　Immunophenotype of umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's Jelly圖3　人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型檢測(cè)

Tab.2　Flow cytometry results of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly表2　人臍帶沃頓膠MSC傳代效應(yīng)的流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)?。?）

2.4人臍帶沃頓膠MSC的分化潛能

2.4.1成骨分化經(jīng)過21 d的誘導(dǎo)，顯微鏡下可見P5代人臍帶MSC可形成成骨細(xì)胞，四環(huán)素的熒光檢測(cè)可見在形成鈣結(jié)節(jié)的位置有紅色熒光信號(hào)，Von kossa染色（蘇木素復(fù)染）可見黑色礦化物沉積，見圖4。

Fig.4　Differentiation potentials of passage 5 of human umbilical cord mesenchymal stromal cells in Wharton's jelly（×100）圖4　體外誘導(dǎo)3周后第5代人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化潛能（×100）

2.4.2心肌分化經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)10 d，顯微鏡下觀察，細(xì)胞朝一個(gè)方向拉長為桿狀，有部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡。誘導(dǎo)30 d，細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切渭靶切?，?xì)胞增殖速度有所減緩。誘導(dǎo)56 d，細(xì)胞變?yōu)殡p核或多核細(xì)胞，細(xì)胞變得較寬大。RT-PCR結(jié)果表明，誘導(dǎo)分化的細(xì)胞有心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5和G?ATA4及心肌肌漿網(wǎng)鈣ATP酶基因、α-肌球蛋白重鏈基因、肌鈣蛋白I基因、α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)，而誘導(dǎo)前的人臍帶沃頓膠MSC均沒有這些心肌細(xì)胞的特異性基因表達(dá)，見圖5。

Fig.5　RT-PCR identification of cardiac differentiation圖5　人臍帶沃頓膠MSC的心肌分化RT-PCR鑒定

3　討論

臍帶為富含膠原和葡萄糖胺聚糖的組織，其中膠原占50%，透明質(zhì)酸占葡萄糖胺聚糖的70%［5］。Wang等［6］將去除血管的臍帶組織刮除沃頓膠組織后，膠原酶消化16 h，培養(yǎng)3 d即可觀察到成纖維樣細(xì)胞生長。Romanov等［7］和Covas等［8］對(duì)臍帶血管系統(tǒng)行酶消化，培養(yǎng)7 d觀察到成纖維樣細(xì)胞。Saru?gaser等［9］將包裹沃頓膠基質(zhì)的臍血管用膠原酶消化，可以觀察到星形的成纖維樣細(xì)胞。Mitchell等［10］用植塊法獲得了MSC，并證明了沃頓膠中的MSC具有前軟骨細(xì)胞的特性［11］。鄭志娟等［12］利用膠原酶、胰酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶等消化沃頓膠發(fā)現(xiàn)只消化臍帶血管收獲細(xì)胞數(shù)為（2.5～25）×104個(gè)/cm臍帶［13］。由此可見利用膠原酶消化整根臍帶組織獲得的有核細(xì)胞數(shù)最多。有研究采用植塊法分離MSC，發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體的臍帶組織MSC爬出的時(shí)間不一致，平均需要2～3周的時(shí)間，如果采用膠原酶消化法培養(yǎng)MSC，2～3周的時(shí)間可以將細(xì)胞至少傳代1～2次［14］?；谏鲜鰣?bào)道和考慮，本研究比較了不同膠原酶消化方法對(duì)分離人臍帶沃頓膠MSC數(shù)量、細(xì)胞活力的影響。因?yàn)槟殠ЫM織富含膠原和透明質(zhì)酸，故實(shí)驗(yàn)選擇Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ型膠原酶消化法。結(jié)果顯示，采用Ⅰ型膠原酶消化法能從人臍帶組織中分離出活性高且數(shù)量較多的MSC，而且細(xì)胞出現(xiàn)伸展的時(shí)間及原代培養(yǎng)時(shí)間均短于使用Ⅱ、Ⅳ型膠原酶消化法。該法簡(jiǎn)單易行，能減少M(fèi)SC丟失，對(duì)細(xì)胞損傷小，培養(yǎng)成功率高，具有大規(guī)模培養(yǎng)的可能。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，91.67%細(xì)胞處于G0/G1期，8.33%細(xì)胞處于活化增殖狀態(tài)的S+G2+M期，說明細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖潛能。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)采用的PI單染法，其缺點(diǎn)是無法區(qū)分G0期和G1期、G2期和M期。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)P4、P7、P10、P15、P20均較高表達(dá)黏附分子受體標(biāo)記CD29、CD44，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73（SH3）、CD105（SH2）及干細(xì)胞標(biāo)記CD90，表達(dá)率均在97%以上。此外，還發(fā)現(xiàn)10代以內(nèi)的臍帶MSC幾乎不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31、造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34和組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，表達(dá)率在1%以下。但是超過10代，陰性標(biāo)記表達(dá)率明顯升高，例如P15和P20代HLA-DR表達(dá)率分別為4.1%和8.9%，P20代CD31和CD34的表達(dá)率為4.1%和3%，這些均說明經(jīng)過多次傳代長期體外培養(yǎng)擴(kuò)增的絕大部分MSC，都已經(jīng)是其分化的后代，即表達(dá)各種分化抗原的、已經(jīng)定向分化的間充質(zhì)細(xì)胞和終末分化而成的各種結(jié)締組織細(xì)胞。由于至今還沒有方法可以在體外純化或克隆化MSC，當(dāng)前唯一的方法是體外富集MSC，即收集培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。因此，在收獲的間充質(zhì)細(xì)胞群中，不可避免地混雜了同樣也貼壁生長的，包括神經(jīng)干細(xì)胞或肝臟干細(xì)胞等各種成體干細(xì)胞。

由于至今尚缺乏鑒定MSC的特異性指標(biāo)，所以在MSC的相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，需要既考慮其一系列的免疫表型，又要驗(yàn)證MSC誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)在成骨誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞的傳代，一部分細(xì)胞會(huì)聚集成白色結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，其周圍的細(xì)胞呈放射狀。MSC可對(duì)肝星狀細(xì)胞有直接調(diào)控的效應(yīng)［15］。心肌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了人臍帶沃頓膠MSC在5-氮胞苷作用下能分化為具有心肌細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，但實(shí)驗(yàn)未觀察到分化細(xì)胞跳動(dòng)的現(xiàn)象，考慮是體內(nèi)外環(huán)境差異，影響到MSC向心肌細(xì)胞的分化，缺乏體內(nèi)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，因而不能形成完全的自發(fā)跳動(dòng)，這仍然需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)得以完善。隨著人們對(duì)MSC更深入的探索，相信MSC作為細(xì)胞和基因治療的靶細(xì)胞，以及種子細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］Hou KD，Lu SB，Yuan M.The applications of the new seed cellsumbilical cord derived-mesenchymal stem cells in tissue engineer?ing［J］.Med J Chin PLA，2007，32（9）：988-990.［侯克東，盧世璧，袁玫.新種子細(xì)胞-臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（9）：988-990］.

［2］Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord［J］.Stem Cells，2004，22 （7）:1330-1337.

［3］Lu LL，Liu YJ，Yang SG，et al.Isolation and characterization of hu?man umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesissupportive function and other potentials［J］.Haematologica，2006，91（8）：1017-1026.

［4］Zhang YQ，Liang J，Tian QS，et al.Optimization of isolation and cul? ture methods of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells［J］.Journal of Mudanjiang Medical University，2013，34（5）:7-9.［張亞倩，梁軍，田沁森，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（5）:7-9］.

［5］Yang WC，Dong YH.The research progress of human umbilical cord mesenchymal stem cells［J］.Journal of Tissue Engineering and Reconstructive Surgery，2010，6（5）：292-294.［楊文成，董有海.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.組織工程與重建外科雜志，2010，6（5）：292-294］.

［6］Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord［J］.Stem Cells，2004，22（7）:1330-1337.

［7］Romanov YA，Svintsitskaya VA，Smirnov VN.Searching for alterna?tive sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord［J］.Stem Cells，2003，21（1）:105-110.

［8］Covas DT，Siufi JL，Silva AR，et al.Isolation and culture of umbili?cal vein mesenchymal stem cells［J］.Braz J Med Biol Res，2003，36 （9）:1179-1183.

［9］Sarugaser R，Lickorish D，Baksh D，et al.Human umbilical cord perivascular（HUCPV）cells:a source of mesenchymal progenitors ［J］.Stem Cells，2005，23（2）:220-229.

［10］Mitchell KE，Weiss ML，Mitchell BM，et al.Matrix cells from Whar?ton's jelly form neurons and glia［J］.Stem Cells，2003，21（1）:50-60.

［11］Sun GD，Li ZZ.The research progress of umbilical cord derivedmesenchymal stem cells in tissue engineering［J］.Progress in Mod?ern Biomedicine，2009，9（12）:2389-2391.［孫國棟，李志忠.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程中的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（12）：2389-2391］.

［12］Zheng ZJ，Zhuang WX，F(xiàn)u WY.Advances of the umbilical cord Mesenchymal stem cells［J］.Progress of Anatomical Sciences，2008，14 （1）:100-104.［鄭志娟，莊文欣，付文玉.人臍帶間充質(zhì)千細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2008，14（1）：100-104］.

［13］Feng K，Xiao L，Ma XH，et al.Isolation，culture and surface markers detection of human umbilical cord mesenchymal stem cells［J］.Jour?nal of Leukemia&Lymphoma，2013，22（6）：354-356.［馮凱，肖漓，馬錫慧，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及表面標(biāo)志檢測(cè)［J］.白血病·淋巴瘤，2013，22（6）：354-356］.

［14］Pang RQ，He J，Li FB，et al.A simple method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cell［J］.Chin J Cell Stem Cell （Electronic Edition），2011，1（2）:30-33.［龐榮清，何潔，李福兵，等.一種簡(jiǎn)單的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法［J］.中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2011，1（2）：30-33］.

［15］Chen LM，Xu RN，Lv S，et al.Role of human umbilical cord mesen?chymal stem cells in the regulation of activation and apoptosis of he?patic stellate cell［J］.Med J Chin PLA，2014，39（1）:11-14.［陳黎明，徐若男，呂颯，等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞活化、凋亡的調(diào)控作用研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39（1）:11-14］.doi：10.11855/j.issn.0577-7402.2014.01.03.

（2014-08-15收稿2014-09-20修回）

（本文編輯閆娟）

Optimization the methodology of isolating human ubilical cord mesenchymal stromal cells from Wharton's jelly and examination of their passage effect on immune phenotype using flow cytometry

HONG Jingxin1，LI Qian1，2，HAN Junling1，2△
1 Union Stem Cell&Gene Engineering Co.，Ltd.，Tianjin Cord Blood Bank，Tianjin 300384，China；2 Institute of Hematology，Blood Disease Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences
△Corresponding Author E-mail:hanjl1@126.com

ObjectiveTo observe the effects of different collagenase digestions on isolating human umbilical cord mesenchymal stromal cells（MSC）from Wharton's jelly，to exam their differentiation ability and to investigate their passage effect on the immune phenotype.MethodsHuman umbilical cord samples were digested by collagenaseⅠorⅡorⅣfor 4-18 hours then were passed through sieves.Cells were collected by centrifugation then inoculated in DMEM/F12 medium at concentration within range of 4.8×103-1×104/cm2to compare the effect of different digestions on MSC.Von kossa staining and tetracycline fluorescence was used to label the osteogenic differentiation capacity of MSC.Also RT-PCR was employed to identify the differentiate capacity of MSC into myocardial-like cells.The immunophenotype of MSCs were detected by flow cytometry after subculture.ResultsUsing collagenaseⅠdigestion，the number of MSCs isolated from human umbilical cord in Wharton's jelly and their vitality were much higher while the period to show cell extension and primary culture time were shorter than those using collagenaseⅡorⅣdigestions.The analysis of surface marker revealed that the expression of positive markers include CD29，CD44，CD73，CD90 and CD105 did not change with passages while the negative markers such as CD31，CD34 and HLA-DR increased significantly with passages；Differential experiments induced in vitro show that human umbilical cord MSC in wharton's jelly had the ability to differentiate into osteoblasts and myocardial-like cells.Con?clusionThe human umbilical cord MSC in Wharton's jelly was successfully isolated by collagenaseⅠdigestion.This meth?od was simple with a high success rate while cell loss and damage were minimum.This makes large-scale cultivation possi?ble.Negative markers increased with cell passages.This phenomenon revealed that MSC showed directional differentiation.

umbilical cord；mesenchymal stem cells；collagenases；passage effect；Wharton's jelly

R394.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.008

1天津，協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司（郵編300384）；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，血液學(xué)研究所，血液病醫(yī)院

洪敬欣（1978），女，高級(jí)工程師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事干細(xì)胞及免疫細(xì)胞研究

△E-mail：hanjl1@126.com