阿爾泰瑞香醇化學(xué)成分提物及其對(duì)癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣別克，地達(dá)爾·巴合提堅(jiān)，帕娜爾·沙吾提巴依，熱依扎·哈斯木汗，阿依努爾·居馬拜

細(xì)胞與分子生物學(xué)

阿爾泰瑞香醇化學(xué)成分提物及其對(duì)癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

善杜哈喜·巴哈提江，木拉提·克扎衣別克△，地達(dá)爾·巴合提堅(jiān)，帕娜爾·沙吾提巴依，熱依扎·哈斯木汗，阿依努爾·居馬拜

目的檢測(cè)阿爾泰瑞香可能含有的化學(xué)成分，測(cè)定阿爾泰瑞香總酚含量，研究阿爾泰瑞香對(duì)食管癌Eca-109細(xì)胞凋亡的影響。方法采用不同化學(xué)定性方法對(duì)阿爾泰瑞香中化學(xué)成分進(jìn)行研究；以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用福林酚比色法測(cè)定了總酚含量；以AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果阿爾泰瑞香含有黃酮、香豆素、糖、生物堿、酚等化學(xué)成分。阿爾泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）中總酚含量為159.78 mg/g，測(cè)定方法平均回收率為99.4%～108.3%，精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.04%。DA-Et處理的食管癌細(xì)胞凋亡率為（29.633± 1.779）%。結(jié)論本研究為阿爾泰瑞香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升與合理應(yīng)用提供了參考，為深入研究阿爾泰瑞香的活性成分提供了依據(jù)。

阿爾泰瑞香；化學(xué)成分；薄層色譜；總酚；Eca-109細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

阿爾泰瑞香為瑞香科瑞香屬植物阿爾泰瑞香（daphne altaica pall）的干燥莖皮，始載于15世紀(jì)哈薩克醫(yī)古典名著Shipagerlik Bayan中。具有發(fā)汗解表、止咳祛痰、溫中止痛的功效［1］，長(zhǎng)期以來(lái)在哈薩克傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中一直用于癌癥和呼吸道疾病的治療［2］，分布于阿爾泰山脈，即新疆準(zhǔn)噶爾盆地以北、哈薩克斯坦東部、俄羅斯的阿爾泰共和國(guó)及蒙古的西北部［3］。自20世紀(jì)70年代初，人們從瑞香科瑞香屬植物中分離出具有抗腫瘤活性的歐亞瑞香素和瑞香毒素后，該屬植物便成為一個(gè)研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)代研究證實(shí)，瑞香屬植物具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗血栓、鎮(zhèn)靜催眠、抗缺氧、抗瘧疾、殺蟲(chóng)等作用［4］。如芫花具有抗腫瘤作用［5］；凹葉瑞香具有抗炎作用［6］；白花歐瑞香具有抗菌［7］、抗氧化［8］作用。瑞香屬植物化學(xué)成分復(fù)雜，從中分離出的化合物有香豆素類(lèi)、雙黃酮類(lèi)、二萜酯類(lèi)、木脂素內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)、三萜類(lèi)、苷類(lèi)等，其中有明顯抗癌活性的有香豆素類(lèi)（如西瑞香素［9］、瑞香素［10］），雙黃酮類(lèi)（如瑞香黃烷B、瑞香黃烷G-3-甲醚、瑞香黃烷G［11］）、二萜酯類(lèi)（如從芫花中分離得到的芫花黃素D、芫花黃素H、芫花黃素J［12］等）和丁香樹(shù)酯醇［13］、瑞香烯酮［14］等。為更好地發(fā)揮阿爾泰瑞香在哈薩克醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，本文對(duì)阿爾泰瑞香化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，用福林酚比色法測(cè)定總酚含量，并研究其對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響，以期為阿爾泰瑞香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升與合理應(yīng)用提供參考，為深入研究阿爾泰瑞香的活性成分提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥材與試劑阿爾泰瑞香（2012年7月由阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)院提供）。95%乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、瑞香素均購(gòu)自SIGMA-ALORICH；西瑞香素（蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司），福林酚試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼斯特生物科技有限公司和中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所）；RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO，美國(guó)）、胎牛血清（杭州四季青）、胰蛋白酶（鵬程）、DMSO（Sigma公司）、凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。其余試劑如三氯化鐵試液、三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑、濃鹽酸、鎂粉、1%三氯化鋁MeOH試液、濃NH4OH試液、改良碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑、20%碳酸鈉溶液等均由本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2儀器PL4002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1750紫外分光光度計(jì)，日本津島公司產(chǎn)品；FD-1-50冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，Lei?ca，德國(guó)。

1.3乙醇提取與萃取阿爾泰瑞香將500 g的阿爾泰瑞香干燥莖皮粉碎后用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇于室溫下浸提3次，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，將浸膏放入低溫冰箱內(nèi)冷凍，用冷凍干燥機(jī)干燥24 h，得阿爾泰瑞香乙醇提取物（DA-Et）粉末。粉末用水分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液和剩余液分別轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮成濃浸膏，將浸膏冷凍，以冷凍干燥機(jī)干燥24 h，即得阿爾泰瑞香的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物。

1.4阿爾泰瑞香化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)首先制備甲醇溶液：取DA-Et粉末5 g，加甲醇100 mL，20℃下超聲處理10 min，搖勻；然后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)測(cè)定阿爾泰瑞香化學(xué)成分。

1.4.1酚類(lèi)和鞣質(zhì)類(lèi) （1）三氯化鐵實(shí)驗(yàn)：取檢品的甲醇溶液1 mL，加三氯化鐵試液2滴，如呈藍(lán)黑色，證明可能含有酚類(lèi)化合物。（2）三氯化鐵-鐵氰化鉀實(shí)驗(yàn)：取檢品的甲醇溶液點(diǎn)在濾紙片上，噴灑三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑，如呈藍(lán)色斑點(diǎn)，證明可能含有酚類(lèi)化合物。

1.4.2黃酮類(lèi) （1）鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)：取檢品的甲醇溶液1 mL，加少量鎂粉，然后加濃鹽酸4～5滴，置沸水浴中加熱2～3 min，如呈桃紅色，表明可能有黃酮類(lèi)化合物存在。（2）三氯化鋁實(shí)驗(yàn)：取檢品的甲醇溶液點(diǎn)于濾紙片上（干后再點(diǎn)1次，使其濃度集中），干后，噴霧1%三氯化鋁甲醇試液，在紫外光燈下觀察，如呈黃色或黃綠色熒光，表明可能有黃酮類(lèi)化合物存在。

1.4.3生物堿 （1）取DA-Et粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入濃氨水試液1 mL，靜置，浸潤(rùn)1 h，精密加入三氯甲烷∶甲醇（4∶1）的混合溶劑25 mL，加熱回流3 h，放冷，過(guò)濾，濾液供做以下實(shí)驗(yàn)。（2）改良碘化鉍鉀實(shí)驗(yàn)：濾液加改良碘化鉍鉀試劑，觀察有無(wú)紅色沉淀生成。（3）碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)：濾液滴加碘-碘化鉀，觀察有無(wú)暗棕色沉淀生成。（4）碘化汞鉀實(shí)驗(yàn)：濾液加碘化汞鉀試劑，觀察有無(wú)淺黃色沉淀產(chǎn)生。

1.5阿爾泰瑞香中西瑞香素和瑞香素的薄層色譜鑒別制備供試品溶液：精確稱取DA-Et粉末75.24 mg，加95%乙醇1 mL，進(jìn)行超聲處理10 min，搖勻即得供試品。對(duì)照品溶液：精密稱取西瑞香素0.39 mg，瑞香素0.41 mg，各加200 μL甲醇，進(jìn)行超聲處理10 min，即得對(duì)照品。吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液，分別以條帶狀點(diǎn)于同一氧化鋁板（10 cm×10 cm）上，以三氯甲烷∶甲醇∶水（8.5∶0.8∶0.05）為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 min后展開(kāi)，待溶液前沿距氧化鋁板前端1 cm時(shí)取出，晾干后，置紫外光燈（波長(zhǎng)365 nm）下檢視。

1.6阿爾泰瑞香對(duì)人食管癌細(xì)胞凋亡的作用

1.6.1高糖環(huán)境培養(yǎng)的Eca-109細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存 （1）復(fù)蘇：從液氮中取出Eca-109細(xì)胞株的凍存管，將其轉(zhuǎn)移到底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞形態(tài)。（2）傳代：細(xì)胞計(jì)數(shù)后以（2～4）×105個(gè)/mL的密度接種到新的25 cm2培養(yǎng)瓶中。置于37℃5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每2 d換培養(yǎng)基1次。（3）凍存：選取生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入凍存培養(yǎng)液（含10%DMSO），凍存液中細(xì)胞的最終密度為（5～10）×106個(gè)/mL，將細(xì)胞梯度凍存，4℃、-20℃、-45℃各梯度放置30～60 min，后轉(zhuǎn)移至-78℃冰箱過(guò)夜，24 h后轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期保存。

1.6.2試藥精密稱取DA-Et粉末，加適量DMSO溶解。待藥物完全溶解后，取50 μL，于12 000 r/min離心10 min，取40 μL，加入60 μL的DMSO，使最終濃度為100 g/L。將培養(yǎng)好的食管癌細(xì)胞以1×106個(gè)/μL接種到培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后用新鮮培養(yǎng)基換液，加0.5 μL的DA-Et后培養(yǎng)24 h，共設(shè)3個(gè)平行組。

1.6.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)食管癌細(xì)胞凋亡情況收集處理24 h的細(xì)胞（培養(yǎng)至80%融合時(shí)），用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2次（2 000 r/min離心5min）。加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞搖勻；室溫，避光反應(yīng)5～15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。

1.7阿爾泰瑞香總酚含量測(cè)定

1.7.1相關(guān)溶液配制 （1）20%碳酸鈉溶液：精密量取20 g碳酸鈉，置100 mL容量瓶用純水溶解并稀釋至刻度。（2）對(duì)照品溶液：精密稱取5 mg沒(méi)食子酸對(duì)照品，置50 mL容量瓶用純水溶解并稀釋至刻度。精密量取該溶液15 mL，用純水定容至50 mL，即得對(duì)照品溶液30 mg/L。（3）樣品溶液：稱取0.05 g DA-Et粉末加入100 mL純水，40℃加熱超聲溶解25 min，冷卻。分別精密量取7.5 mL樣品溶液共5份，用純水定容至10 mL。

1.7.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定精密吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液2.5 mL和供試品溶液1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入純水至5.0 mL，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻6 min后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下避光反應(yīng)2 h。以試劑溶液為空白，于500～900 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。

1.7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取上述對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，加入純水至5 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，搖勻6 min后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下避光反應(yīng)2 h。以第1個(gè)溶液為空白，在745 nm波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品溶液的吸光度，以對(duì)照品的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.4精密度實(shí)驗(yàn)精密量取同一批已知濃度的供試品溶液5份，每份1.0 mL，分別按1.7.3中的方法，以試劑溶液為空白對(duì)照，進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)3次。

1.7.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取同一批已知濃度的供試品溶液10份，每份1.0 mL，分2組，一組各加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0.5 mL，另一組各加入1.0 mL，分別按1.7.3項(xiàng)方法下顯色，以試劑溶液為空白對(duì)照，進(jìn)行含量測(cè)定，重復(fù)3次，并計(jì)算回收率。

1.7.6DA-Et中總酚含量測(cè)定及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取5份DAEt，每份約3.75 mg，加入10 mL純水于40℃加熱超聲溶解25 min，冷卻。各取供試品溶液1.0 mL，分別按1.7.3中的方法測(cè)定并計(jì)算總酚含量（mg/g）=C/10 m；C為10 mL供試品溶液中總酚濃度（g/L），m為供試品取樣量（g）。

2　結(jié)果

2.1阿爾泰瑞香化學(xué)成分初步分析結(jié)果DA-Et中可能含有黃酮、生物堿、酚類(lèi)化合物，見(jiàn)表1。

Tab.1　Chemical constituent of Daphne altaica pall表1　阿爾泰瑞香化學(xué)成分

2.2薄層色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果供試品與對(duì)照品在同一薄層板相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

Fig.1　TLC of UV chromatogram圖1　365 nm紫外光下（A）和日光下（B）的色譜圖

2.3流式細(xì)胞檢測(cè)食管癌細(xì)胞凋亡結(jié)果Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)圖上可見(jiàn)經(jīng)DA-Et處理后的Eca-109細(xì)胞在Annexin V-FITC+、PI-象限中的分布顯著，見(jiàn)圖2。DA-Et處理后的細(xì)胞凋亡率為（29.633±1.779）%。

Fig.2　The apoptosis rate of esophageal cancer cell line after treatment of DA-Et圖2　DA-Et處理后的食管癌細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

2.4總酚含量的測(cè)定結(jié)果沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液在745 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，供試品溶液在此波長(zhǎng)也有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)為745 nm，見(jiàn)圖3。

Fig.3　Absorbtion spectrogram of sample and standard solution圖3　樣品與沒(méi)食子酸對(duì)照品的吸收光譜圖比較

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.04%，說(shuō)明此方法穩(wěn)定性良好。

2.4.3加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果加樣回收率為99.4%～108.3%，表明此方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度較高，見(jiàn)表3。

Tab.3　Recovery rate of sample solution表3　供試品溶液的加樣回收率

2.4.4DA-Et總酚含量測(cè)定及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)DA-Et中總酚含量為（159.78±1.90）mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.19%，表明具有很好的重現(xiàn)性。

3　討論

阿爾泰瑞香作為哈薩克民間常用藥之一，在治療風(fēng)寒感冒、氣管炎、咳嗽、胃痛不適、關(guān)節(jié)炎、咽痛、牙痛、食管癌、胃癌方面有著很獨(dú)特的療效。雖然阿爾泰瑞香在哈薩克傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已用于食管癌等惡性腫瘤的治療，國(guó)內(nèi)外也有有關(guān)黃瑞香、唐古特瑞香等瑞香屬植物的研究報(bào)道，但其抗腫瘤有效部位及有效成分不明確，尚未見(jiàn)有關(guān)阿爾泰瑞香化學(xué)成分及藥理作用的文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)發(fā)明專利。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)薄層色譜鑒別及化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步檢定了阿爾泰瑞香可能含有黃酮、香豆素、糖、生物堿、酚類(lèi)化合物等成分，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用福林酚比色法測(cè)定阿爾泰瑞香中的總酚含量，此方法具有操作簡(jiǎn)便快捷，設(shè)備要求低，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是檢測(cè)阿爾泰瑞香總酚的可靠方法。用Annexin-V單陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，An?nexin-V與PI雙陽(yáng)性為壞死細(xì)胞，雙陰性細(xì)胞為活細(xì)胞分析DA-Et處理24 h的食管癌細(xì)胞的凋亡，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到DA-Et具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。對(duì)阿爾泰瑞香的抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行研究具有較大實(shí)際意義和較高的學(xué)術(shù)價(jià)值。本研究豐富了阿爾泰瑞香化學(xué)成分的研究資料，為今后深入研究哈薩克藥資源的調(diào)查，提升阿爾泰瑞香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，研究阿爾泰瑞香抗癌機(jī)制提供了可借鑒的科學(xué)依據(jù)。

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（2014-07-15收稿2014-09-10修回）

（本文編輯閆娟）

Chemical constituents of ethanol extracts from Daphne altaica pall and their pro-apoptotic role in cancer cell

BAHYTJAN Sandugash，KIZAIBEK Murat△，BAHYTJAN Didar，SAWYTBAI Panar，KASYMKAN Ryza，JUMABAI Ainur
Traditional Kazakh Medicine Research Institute of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，TCM Hospital of Ili Kazakh Autonomous Prefecture，Yili 835000，China
△Corresponding Author E-mail：murat_kizaibek@sina.com

ObjectiveTo investigate the chemical constituents of the ethanol extract of Daphne altaica Pall（DA-Et），to determine total phenolic content in DA-Et and to study the effect of DA-Et on cell apoptosis in Eca-109 cells.Meth?odsDifferent chemical assays were performed to detect chemical constituents of DA-Et.The content of total phenolics，ex?pressed as gallic acid equivalents，was measured by Folin-Ciocalteu assay；Cell apoptosis induced by DA-Et was detected by AnnexinV-FITC/PI flow cytometry.ResultsFlavonoids，coumarins，sugars，alkaloids and phenolics in DA-Et.The contents of total phenolics in DA-Et was quantified as 159.78 mg/g.Average recovery rate of this method ranged from 99.4%to 108.3%and the precision relative standard deviation was 2.04%.Apoptosis rate of Esophageal cancer cell line Eca-109 induced by DA-Et was detected as 29.633%±1.779%（n=3）.ConclusionOur study provide guidance for the im?provement of DA-Et quality，its appropriate application and further research of its activity.

Daphne altaica Pall.；chemical constituents；TLC；total phenolics；Eca-109 cells；cell apoptosis

R282，R735.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360499）；新疆地產(chǎn)中藥民族新藥研發(fā)項(xiàng)目（XJHPHY-2010-YH）；自治區(qū)科研機(jī)構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項(xiàng)資金（2013002）；伊犁哈薩克自治州科技計(jì)劃項(xiàng)目（YZ201201034）

伊犁哈薩克自治州哈薩克醫(yī)藥研究所、伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院（郵編835000）

善杜哈喜·巴哈提江（1990），女，學(xué)士學(xué)位，主要從事哈薩克藥研究

△E-mail：murat_kizaibek@sina.com