曇花總黃酮提取工藝研究

張振國，鄒 翔，徐 陽，王 震，劉 影，趙靜文，張逸喬，曲中原，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)英才學(xué)院，哈爾濱150028;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150076)

《陸川本草》記載曇花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]又名瓊花、月下美人，屬仙人掌科曇花屬植物，其花、莖入藥.曇花(Epiphyllum Flos)具有清肺止咳、涼血止血、養(yǎng)心安神之功效.主治肺熱咳嗽、肺癆、咯血、崩漏、心悸、失眠等癥[1].目前對曇花的研究主要集中在植物栽培和化妝品應(yīng)用方面[2－3]，而對其藥用價值并沒有深入研究.中國科學(xué)院上海藥物研究所吳斌等人對其化學(xué)成分進(jìn)行初步研究，從曇花甲醇提取物的乙酸乙酯萃取部分分離出9個化合物，主要為黃酮類成分[3].黃酮類化合物具有多種生物活性，在食品和醫(yī)藥工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用.目前關(guān)于曇花黃酮類化合物的提取和活性研究還未見報道.本實驗旨在單因素考查實驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝，為進(jìn)一步的藥理活性研究及曇花藥用植物資源的充分利用和合理開發(fā)提供實驗依據(jù).

1 實驗儀器與藥品

FW135、177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見分光光度計(北京普斯通用儀器有限公司);HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省壇市榮華儀器制造有限公司);98－1－B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);BS110S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－III循環(huán)水多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠).

曇花(Epiphyllum Flos)藥材為仙人掌科植物曇花[Epiphyllum oxypeta lum(DC.)]的干燥花，購于福建省泉州，為初秋采集花，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定.金絲桃苷對照品購于天津一方可以有限公司，純度98%以上.乙醇為分析純.

2 實驗方法

2.1 樣品預(yù)處理

取干燥曇花，粉碎，過40目篩，待用.

2.2 曇花總黃酮的提取

精密稱取處理好的樣品粉末(40目)5.00g于圓底燒瓶中，按照一定的料液比、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度水浴回流提取.提取2次，合并提取液轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至小體積，移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，用70%乙醇溶解定容至100 mL.

2.3 單因素實驗設(shè)計

乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取5.00 g曇花粉末5份，固定提取溫度為80℃，料液比為1∶30，提取時間為3 h，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%，95%的乙醇溶液進(jìn)行回流提取.

提取溫度精密稱取5.00 g曇花粉末5份，固定提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶30，提取時間為3 h，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行回流提取.

提取時間精密取5.00 g曇花粉末5份，提取溫度為80℃，提取溶劑為70%乙醇，料液比為1∶30，提取時間為 3 h，分別設(shè)定 2、3、4、5、6 h 進(jìn)行回流提取.

料液比 精密稱取5.00 g曇花粉末5份，提取溫度為80℃，提取溶劑為70%乙醇，提取時間為3 h，料液比分別為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 進(jìn)行回流提取.

2.4 曇花總黃酮提取工藝的正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)以及提取時間(C)為實驗因素進(jìn)行考察，按照L9(34)正交表進(jìn)行實驗，進(jìn)一步優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝.因素水平如表1所示.

表1 實驗因素水平L9(34)表

2.5 曇花總黃酮百分含量測定

2.5.1 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取金絲桃苷對照品10.00 mg，用無水乙醇定容至100 mL，則金絲桃苷對照品溶液的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL.準(zhǔn)確移取對照品溶液0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 mL 至 10.00 mL容量瓶，分別加蒸餾水定容至10 mL，混勻，放置15 min后，用紫外分光光度計在378 nm處測量其吸光度[4－5]，以吸光值為縱坐標(biāo)，金絲桃苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.線性回歸方程為 y=26.73x+0.016(r=0.999 6)，金絲桃苷在 0.01 ～0.06 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.5.2 方法學(xué)考察

1)精密度實驗 取金絲桃苷對照品溶液(0.1 mg/mL)在378 nm波長處連續(xù)6次測定吸光度，RSD值為0.17%，表明本實驗精密度良好.

2)穩(wěn)定性實驗 取同一質(zhì)量濃度的供試品溶液，于 0，2，4，8，10，24 h 測定吸光度值，RSD 為0.11%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

3)重復(fù)性實驗 精密稱取5.00 g曇花粉末6份，分別采用80%乙醇熱回流提取，提取溫度為90℃，提取4 h，料液比為 1∶40(m/V)，提取 2次，按照“2.2”項下制備成供試品溶液，在378 nm波長處測定吸光度值.RSD值為0.58%，表明實驗重復(fù)性良好.

4)加樣回收率實驗精密量取曇花粉末(總黃酮百分含量為1.15%)6份，每份 0.1 g，分別加入金絲桃苷對照品約1 mg，分別采用80%乙醇熱回流提取，提取溫度為70℃，提取4 h，料液比為1∶40(m/V)，提取 2 次，按照“2.2”項下制備成供試品溶液，在378 nm波長處測定吸光度值，計算加樣回收率為(97.10±1.38)%，RSD 值為1.03%，表明百分含量測定結(jié)果準(zhǔn)確.

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗結(jié)果

單因素考察結(jié)果顯示當(dāng)80℃熱回流提取，料液比1∶30，提取3 h時，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%提取的總黃酮百分含量最高;當(dāng)取70%乙醇，料液比1∶30，提取3 h時，提取溫度為80℃提取的總黃酮百分百分含量最高;當(dāng)80℃ 70%乙醇熱回流提取，料液比1∶30時，提取時間為6 h的總黃酮百分含量最高;當(dāng)80℃70%乙醇熱回流提取3 h時，料液比大于1∶40(m/V)時曇花總黃酮百分含量增加趨于平緩，基本穩(wěn)定.見表2.

表2 單因素實驗結(jié)果

3.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度以及提取時間的較好水平進(jìn)行正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化曇花總黃酮的提取工藝.正交試驗結(jié)果如表3所示.從分析結(jié)果來看，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時間對曇花總黃酮的百分含量均有影響，影響的大小順序為:乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時間.根據(jù)正交試驗的結(jié)果(總黃酮的百分含量)，得出曇花總黃酮提取的最佳實驗條件為A2B3C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，提取溫度為90℃，提取時間為4 h.

3.3 驗證實驗

按照優(yōu)選出來的最佳工藝條件進(jìn)行驗證實驗，測定平均總黃酮百分含量為 1.18%，RSD為1.84%，工藝穩(wěn)定.見表3、4.

表3 正交試驗設(shè)計及實驗結(jié)果

表4 正交試驗結(jié)果方差分析

4 結(jié)語

通過以上研究可知乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取溫度、提取時間以及料液比對曇花總黃酮的百分含量均有影響.正交試驗確定的因素影響的大小順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時間.曇花總黃酮提取的最佳實驗條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度90℃，提取時間4 h，料液比1∶40(m/V)，提取2次.該工藝操作簡便、可行，為曇花總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為曇花作為藥用資源進(jìn)行開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ).

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.864－865.

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[5]張 慧，王 遂.雙水相法和微波法提取假酸漿中總黃酮及純化[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2014，30(2):220－223